• 한국미생물·생명공학회지
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• 제49권2호
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• pp.181-191
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• 2021

The present study addresses isolation, optimization, partial purification, and characterization of a haloalkaline serine protease from a newly isolated haloarchaeal strain isolated from Wadi El Natrun in Egypt. We expected that a two-step sequential statistical approach (one variable at a time, followed by response surface methodology) might maximize the production of the haloalkaline serine protease. The enzyme was partially purified using Hiprep 16/60 sephacryl S-100 HR gel filtration column. Molecular identification revealed the newly isolated haloarchaeon to be Natrialba hulunbeirensis strain WNHS14. Among several tested physicochemical determinants, casamino acids, KCl, and NaCl showed the most significant effects on enzyme production as determined from results of the One-Variable-At-A-time (OVAT) study. The BoxBehnken design localized the optimal levels of the three key determinants; casamino acids, KCl, and NaCl to be 0.5% (w/v), 0.02% (w/v), and 15% (w/v), respectively, obtaining 62.9 U/ml as the maximal amount of protease produced after treatment at 40℃, and pH 9 for 9 days with 6-fold enhancement in yield. The enzyme was partially purified after size exclusion chromatography with specific activity, purification fold, and yield of 1282.63 U/mg, 8.9, and 23%, respectively. The enzyme showed its maximal activity at pH, temperature, and NaCl concentration optima of 10, 75℃, and 2 M, respectively. Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, 5 mM) completely inhibited enzyme activity.

• 한국식품과학회지
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• 제25권6호
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• pp.703-709
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• 1993

쌀가루의 압출 조리조건과 단순 열처리조건에 따른 쌀전분의 분자량 분포와 ${\alpha}-amylase$ 민감성 변화를 조사하였다. 압출조리는 단일축 압출성형기를 이용하였으며 원료의 수분함량 $17{\sim}29%$, 압출온도 $100{\sim}150^{\circ}C$ 범위에서 처리하였다. 단순 열처리는 원통형 ???L슐에 시료를 밀봉하여 $100{\sim}200^{\circ}C$ 유탕기내에서 일정시간 가열하였다. 이들 가열처리된 시료를 다시 ${\alpha}-amylase$를 처리하여 가수분해속도를 측정하였다. 쌀 전분 원료미분의 수분함량이 23% 이하일 때 압출조리시 수분용해도와 분자량 감소가 크게 일어났으며 이러한 변화는 extruder의 기계적 에너지 투입량(MEI)과 비례하였다. 한편 단순 열처리에서는 원료 수분함량이 높아짐에 따라 가열에 의한 분자량 감소가 감지되었으나 그 변화정도는 압출조리에 비교하여 저조하였다 열처리된 시료를 ${\alpha}-amylase$로 처리하였을 경우 수분함량 23% 이하에서 압출조리된 시료는 효소적 가수분해가 크게 일어나 대부분의 전분입자가 5백만 dalton 이하의 분자량을 가지게 되었으나 고수분 압출물과 단순 열처리에서는 효소처리에 의한 분자량 감소가 크게 나타나지 않았다. 이러한 분자량 변화 현상은 전분용액의 고유점도 변화에 의하여 확인되었다. 이러한 결과는 쌀전분의 저분자화에 의한 수용성 증가 및 효소반응 민감성 증대는 단순 열처리보다는 압출조리에 의하여 크게 일어나며 이것도 extruder 내에서 가열과 동시에 가해지는 강한 압력과 층밀림에 의하여 전분입자의 변형이 크게 일어나는 것을 입증하는 것이다.

• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제1권2호
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• pp.201-208
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• 1998

A protease, which had no tryptic and chymotryptic activity, was purified from the hepatopancreas of shrimp, P. japonicus, through ammonium sulfate fractionation, Q­Sepharose ionic exchange, benzamidine Sepharose 6B affinity, and Sephacryl S-100 gel chromatography. Molecular weight (M.W.) of the protease was estimated to be 24 kDa by gel filtration and showed a single peptide band by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The protease had a low ratio of acidic to basic amino acids, which is different with pro teases from marine animals. The enzyme was partially inhibited by benzamidine, tosyl-L-lysine chioromethyl ketone (TLCK), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), soybean trypsin inhibitor (SBTI), and pepstatin. The enzyme did not have any activity against benzoyl-D,L-arginine p-nitroanilide (BAPNA) or benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (BTEE) which is a specific substrate of trypsin and chymotrypsin, respectively. However, the enzyme showed activity forward N-CBZ-L-tyrosine p-nitrophenyl ester (CBZ-Tyr-pNE), N­CBZ-L-tryptophan p-nitrophenyl ester (CBZ-Trp-pNE), and N-CBZ-L-proline p-nitrophenyl ester (CBZ-Pro-pNE). The protease did not showed tryptic and chymotryptic activity, which was not reported in shrimp hepatopancreas.

• BMB Reports
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• 제37권4호
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• pp.466-473
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• 2004

A new acid deoxyribonuclease (DNase) was purified from the cultured mycelia of Cordyceps sinensis, and designated CSDNase. CSDNase was purified by $(NH_4)_2SO_4$ precipitation, Sephacryl S-100 HR gel filtration, weak anion-exchange HPLC, and gel filtration HPLC. The protein was single-chained, with an apparent molecular mass of ca. 34 kDa, as revealed by SDS-PAGE, and an isoelectric point of 7.05, as estimated by isoelectric focusing. CSDNase acted on both double-stranded (ds) and single- stranded (ss) DNA, but preferentially on dsDNA. The optimum pH of CSDNase was pH 5.5 and its optimum temperature 55. The activity of CSDNase was not dependent on divalent cations, but its enzymic activity was inhibited by high concentration of the cation: $MgCl_2$ above 150 mM, $MnCl_2$ above 200 mM, $ZnCl_2$ above 150 mM, $CaCl_2$ above 200 mM, NaCl above 300 mM, and KCl above 300 mM. CSDNase was found to hydrolyze DNA, and to generate 3-phosphate and 5-OH termini. These results indicate that the nucleolytic properties of CSDNase are essentially the same as those of other well-characterized acid DNases, and that CSDNase is a member of the acid DNase family. To our knowledge, this is the first report of an acid DNase in a fungus.

• BMB Reports
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• 제29권6호
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• pp.555-563
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• 1996

A membrane-bound phosphatidylinositol 4-kinase (PI 4-kinase) was separated in a sucrose gradient and solubilized with 1% Triton X-100 from mouse brain. The enzyme was purified 2,952-fold by various chromatographic techniques including DEAE-cellulose, PI-Sepharose and Sephacryl S-200 gel filtration. The molecular weight of PI 4-kinase was approximately 76 kDa by gel filtration and 70.8 kDa by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The purified enzyme exhibited specific activity of 11.2 nmol/min/mg protein and pi value of 4.7. Kinetic analysis of the PI 4-kinase indicated apparent $K_m$, values of 190 ${\mu}M$ and 120 ${\mu}M$ for phosphatidylinositol and ATP, respectively. The maximal activity of this purified enzyme was observed at pH 7.4 at an incubation temperature of $37^{\circ}C$. The enzyme activity was significantly activated by $Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$ and $Fe^{2+}$, and inhibited severely by $Ca^{2+}$. PI 4-kinase was proved to be pure in its immunoblot test by polyclonal antibody prepared from immunized rabbit sera. By this test, we were able to detect the existence of the same type of PI 4-kinase from other mouse organ tissues, such as liver, heart, kidney and spleen. Furthermore, similar immunoblot analysis with the same antisera recognized the different epitopes of PI 4-kinase proteins from various organs of rabbit, chinese hamster and rat.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권4호
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• pp.323-330
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• 1998

호알카리성 Bacillus firmus var. alkalophilus가 생산하는 cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 호화시킨 팽윤감자전분을 이용한 흡착 및 탈착, 한외여과, DEAE-cellulose 이온교환 크로마토그래피, 그리고 Sephacryl HR-100을 이용한 gel filtration 등의 분리정제 과정을 통하여 정제하였다. 정제된 CGTase의 분자량은 약 77,000 Da이었으며, 등전점은 6.2～6.3이었다. 최적 효소반응 온도 및 pH는 각각 5$0^{\circ}C$ 와 6.0 였고, 열 및 pH 안정성은 5$0^{\circ}C$까지와 pH 6.0~9.5 사이였다, 정제된 CGTase는 $Ca^{2+}$ 에 의하여 열 안정성이 크게 상당히 향상되었으며 최적 효소반응 온도와 열 안정성도 55~6$0^{\circ}C$와 6$0^{\circ}C$로 증가하였다. CGTase의 기질 특이성을 검토한 결과 여러 종류의 전분들로부터 $\beta$-CD를 주로 생성하였으며, ${\gamma}$-CD도 소량 생성하였으나 $\alpha$-CD는 거의 생성되지 않았다. Sweet potato starch, corn starch, 그리고 amylopectin을 기질로 할 때 높은 CD전환율을 보였으며 $\beta$-CD와 ${\gamma}$-CB의 생성비가 5.8~8.4:1로서 $\beta$-CD를 고 수율로 생산하는 전형적인 $\beta$-type의 CGTase였다. 또한 본 효소의 최적 CD 생산조건은 기질농도 5.0%(w/v) corn starch, 효소첨가량 25 unit/g of starch로서 반응 8시간 후의 전체 CD량도 약 25 g/l로서 전환율은 50%였고, 이 때 $\beta$-CD농도는 21 g/l로서 전체 CD 중 84% 였다.

• 한국수산과학회지
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• 제27권5호
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• pp.482-494
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• 1994

우리나라에서 대량 생산되고 있는 진주담치 근육에서 Triton X-100를 사용하여 carotenoprotein을 추출, 정제하여 그 특성을 실험한 결과를 요약하면 다음과 같다. Carotenoprotein(${\lambda}_{max}=462nm$)를 $20\%$(w/v) $(NH_4)_2SO_4$, DEAE-cellulose 이온교환수지 그리고 Sephacryl S-300 겔 크로마토그래피를 통해 정제한 결과, 정제도는 5배 증가하였고 수율은 $1.85\%$였으며, carotenoprotein의 분자량은 약 372KDa(gel filtration)이었고, SDS-PAG 전기영동으로 단백질의 subunit를 확인한 결과, 60KDa($23.70\%$), 46.9KDa($9.14\%$), 26KDa($49.14\%$) 및 13KDa($18.02\%$)로 이루어져 있었다. Carotenoprotein의 안정성은 pH 4.0 이하의 강산 및 pH 10.0 이상의 강알칼리에서는 단백질이 불안정하였고, SDS 변성제를 $0.2\%$(w/v)되게 첨가하여 녹인 후 가시부 영역($400{\sim}600nm$)에서 최대파장 변화를 보면 462nm에서 456nm로 약 6nm 단파장 영역으로 이동한 것을 알 수 있었다. Carotenoprotein의 구성아미노산 조성은 threonine이 $35.90\%$로 다른 아미노산에 비해 함량이 높았으며, 필수아미노산과 소수성 아미노산의 함량은 전체아미노산 함량의 각각 $62.76\%$와 $25.02\%$를 차지하였고, methionine, histidine 및 proline은 존재하지 않았다. Carotenoprotein 1g당 총지질의 함량은 256mg였고, 그 구성지방산의 조성은 polyene산이 $62.4\%$로 가장 많았고 다음으로 포화산($19.58\%$)및 monoene산($18\%$) 순이었다. 특히, 16:4n-3의 조성비가 $33.90\%$로 상당히 높게 나타났고, EPA, DHA 등 w3 계의 장쇄(長鎖)고도불포화지방산의 조성비가 $22.13\%$로 높게 나타났으며, 양적으로 많은 지방산은 포화산 중에는 palmitic acid($C_{16:0}$), monoene산 중에서는 palmitoleic acid($C_{16:1}$), polyene산 중에서는 hexadecatetraenoic acid($C_{16:4}$), eicosapentaenoic acid ($C_{20:5}$), docosahexaenoic acid($C_{22:6}$) 등이 함량이 많았다. Carotenoprotein으로부터 분리한 총 caroteoid 함량은 $8.80mg\%$였고, 주 carotenoid는 mytiloxanthin($74.79\%$), 3,4,3'-trihydroxy-7',8'-didehydro-${\beta}$-carotene($18.26\%$)였다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제31권3호
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• pp.527-533
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• 2002

전통차 제조용 식물 63종을 대상으로 macrophage lysosomal enzyme activity를 검색한 결과, 홍화 냉수 추출물에서 높은 macrophage lysosomal enzyme 활성 (219%)을 발견하여 냉수 추출물 CT-0 획분에 대하여 metahnol 환류, ethanol 침전, 투석, 동결건조를 실시하여 macrophage lysosomal enzyme 활성이 더욱 증가된(227%) 고분자 획분 CT-1을 얻었다. 이 획분의 macrophage활성화 성분의 본체를 파악하기 위하여 pronate처리에 의한 단백질 분해와 periodate를 이용한 당 부위의 선택적 실활 후 활성을 검토한 결과, pronase를 처리한 CT-1에서는 약 8% 정도의 활성 증가를 보인반면 periodate 산화물에서는 활성이 약 8% 정도 감소되는 것으로 보아 홍화로부터 macrophage 활성을 나타내는 냉수 추출물의 활성 본체는 다당임을 알 수 있었다. 조다당 활성획분에 대하여 anion exchange column chromatography를 실시하여 9개의 획분(CT-1-I~CT-1-VIII)을 얻었으며 수율과 활성이 가장 높은 CT-1-IIa 획분을 Sepharose CL-6B 및 Sephacrl S-200의 gel permeation chromatography를 수행하여 주요 활성 다당인 CT-1-IIa-2-1을 최종적으로 정제하였다. HPLC상에서 순수한 단일 peak로 확인된 CT-1-IIa-2-1은 분자량이 68 kDa정도의 다당인 것으로 나타났고 macrophage의 lysosomal enzyme 활성은 대조군을 100%로 비교했을 때 243%를 나타내었다. 또한 구성당의 조성은 xylose(27.4%), arabinose(16.1%), mannose(15.9%), glucose(14.5%)의 순이었다. 본 연구에서 CT-1-IIa-2-1은 macrophage의 면역활성을 증가시키는 물질임이 확인되었으나 mouse를 대상으로 급성독성 검사를 실시한 결과 LD$_{50}$값이 397mg/kg으로 일정 농도 이상의 고농도에서는 독성을 나타냈다. 따라서 본 시료에 대하여 아만성.만성 독성과 유전 및 면역 독성과 같은 구체적인 독성 검사를 실시하여 안전농도를 산출한다면, 면역증강물질로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.다.

• 한국수산과학회지
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• 제29권3호
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• pp.309-319
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• 1996

어체 중에 분포하는 단백질분해효소를 어류가공 부산물의 회수 이용 측면에서 검토코자 혈합육어 (멸치와 전어)와 백색육어 (농어와 도다리)의 육과 내장에서 추출한 조효소에 대하여 식염농도의 차이가 활성에 미치는 영향, 그리고 진공동결건조와 glycerol의 혼합이 저장 중 단백질분해능에 미치는 영향 등에 관하여 검토하였다. 그리고 멸치의 육과 내장 단백질분해 조효소에 대하여는 효소작용 시간별로 방어근원섬유단백질의 분해 생성물에 대한 Sephacryl S-100 gel chromatography 및 $C_{18}$ reversed phase HPLC chromatography분석도 병행하였다. 육에서 추출한 단백질분해 조효소는 casein과 방어 근원섬유단백질 기질에 대하여 식염농도의 증가와 더불어 효소활성의 저해도 증대하였으며, 효소활성의 저해도는 방어근원섬유단백질에 비하여 casein기질에서, 혈합육어 단백질분해 조효소보다는 백색육어의 단백질분해 조효소에서 더욱 현저하였다. 내장에서 추출한 단백질분해 조효소의 경우, 혈합육어 단백질 분해 조효소는 식염농도의 차이에 의하여 효소활성에 미치는 영향이 적었으나 백색육어의 단백질분해 조효소는 활성의 현저한 저하를 초래하였다. 전어와 농어의 육 및 내장 단백질분해 조효소의 활성에 미치는 동결건조 및 glycerol혼합에 의한 영향을 저장중에 비교한 결과, 기질의 종류에 따라 차이가 있었지만, 전어의 육과 내장 단백질분해 조효소에 비하여 농어의 육과 내장 단백질분해 조효소가 훨씬 불안정하였다. 멸치육과 내장 단백질분해 조효소의 방어근원섬유 단백질에 대한 가수분해작용은 반응초기에 신속히 진행되었고, 가수분해물의 생성량은 첨가된 단백질분해 조효소의 비율에 따라 규칙적으로 증가하였다. 그리고, 효소작용에서 생성한 가수분해물을 분석한 결과, 효소작용시간의 경과와 더불어 세분화된 획분의 종류와 양이 점차 증가하였으며, 이 같은 경향은 근육 단백질분해 조효소에 비하여 내장 단백질분해 조효소에서 더욱 현저하였다. 이 결과는 효소분해생성물의 종류와 양이 규칙적으로 분해되어 일정한 분해생성물이 증가하여 가는 것을 암시하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제37권2호
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• pp.206-213
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• 2005

본 연구에서는 32종 생약재로부터 70% 에탄올과 물 추출물을 제조하고, 이들의 항균, 항곰팡이, 항암, 항고혈압활성을 조사하였다. 생약재외 추출물 제조는 32종의 생약재를 100에서 2시간동안 추출한 후 동결 건조하였다. 항균활성은 6종의 병원성 미생물을 사용하여 32종 생약재의 물 추출물과 70% 에탄올추출물에 대해 조사하였다. 그중 가자의 물 추출물과 70% 에탄올 추출물을 $125{\mu}g$ 첨가했을 때 14mm 이상의 항균 억제환을 나타내어 가장 좋은 항균활성을 보였다. 항곰팡이 활성은 5종의 곰팡이를 사용하여 32종 생약재의 물 추출물과 70% 에탄올추출물에 대해 paper disc확산법으로 조사하였다. 그 결과 계피의 70% 에탄올추출물을 $1000{\mu}g$ 첨가했을 때 10mm이상의 항균 억제환을 보여 가장 좋은 항곰팡이 활성을 나타내었다. 32종의 생약재 물 추출물과 70% 에탄을 추출물에 대한 ACE저해 활성을 조사하였다. 그 결과 파고지의 물 추출물이 10mf/mL의 농도에서 65.2%의 억제율을 나타내었으며, 파고지의 물 추출물로부터 sephacryl S-300 컬럼으로 분획한 Fr I의 분획물이 5mg/mL의 농도에서 81.1%의 억제율을 나타내었다. 생약재의 물 추출물과 70%에탄올 추출물의 세포독성을 조사하였다. 선정된 6종의 생약재중 정향의 에탄올 침전분획이 암세포에 대해 가장 우수한 세포독성을 나타내었다.