• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.33-43
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• 2013

식품으로서 안전하게 섭취하여 혈전증을 사전에 예방하거나 개선할 수 있도록 하기 위하여, 전통적 방법으로 제조한 청국장으로부터 미생물을 분리하여 혈전분해 효소활성이 우수한 미생물을 선발 동정한 결과, Bacillus amyloliquefaciens HC188이라 명명하였다. 선발미생물이 생산하는 혈전분해효소를 분리 및 정제한 결과, 50.7배의 정제도와 5.5%의 수율을 나타내었고, 혈전분해 효소단백질의 분자량은 22.3 kDa이었으며, N-terminal 아미노산 서열은 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Tyr-Gly-Val-Ser-Gln-Ile-Lys-Ala-Pro-Ala로 분석되었다. 효소의 최적반응 pH와 온도는 pH 8.0과 $40^{\circ}C$로 나타났으며, pH 6.0-8.0과 $20-40^{\circ}C$ 사이에서 효소가 비교적 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 2 mM과 5 mM 농도의 $CoCl_2$와 $CaCl_2$의 금속이온이 존재할 때 효소활성이 증가하였으며, inhibitor로서 EDTA와 PMSF에 의해 효소활성이 저해되므로 청국장에서 분리한 B. amyloliquefaciens HC188가 생성한 혈전분해 효소는 metallo-serine protease로 사료되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제35권6호
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• pp.1135-1142
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• 2003

본 연구는 김치의 발효 말기에 비타민 C의 증가 현상을 조사하였으며, 이는 김치 발효 후기에 생육하는 효모에 의한 현상으로 미생물인 효모에서 비타민 C 생합성 경로를 밝히기 위해 수행된 것으로 그 결과는 다음과 같았다. 김치의 숙성에 따른 pH와 총 산함량의 변화는 김치가 숙성되면서 pH는 담금 초기 5.29에서 숙성 33일에 pH 3.50으로 감소되었고, 총 산함량은 담금 초기 0.24%에서 숙성 33일에 2.48%로 증가되었으며, 비타민 C의 함량을 측정한 결과 발효 3일째까지 점점 상승하다 감소되었으나, 발효 15일째는 19.58mg%로 초기 함량보다 다소 높게 측정되었다. 김치의 PG 활성은 김치 숙성초기에는 낮았으나, 김치 숙성 10일 이후부터 증가되어 발효 13일에는 15.4unit/mg protein으로 PG활성이 증가하는 경향을 보였다. 김치에서 분리된 효모 중 배양액의 비타민C의 함량이 높게 측정된 효모를 선별하였으며, 동정결과 Pichia onychis, Pichia rabaulenis, Pichia jadinii, Candida humilis로 각각 동정되었다. 분리, 동정된 효모 중 비타민 C생성량이 가장 높았던 Pichia onychis 16-4 균주로부터 비타민 C 합성 조효소액을 추출하였으며, specific activity는 7.26unit/mg protein로 나타났다. 최종 정제 시 효소활성은 4,698unit/mg protein으로 나타나 처음보다 647.10배로 농축되었음을 알 수 있었다. 정제된 효소액의 분자량은 31,000, 39,000, 50,000 KD으로 3개의 subunits를 갖는 것이 확인되었다. 정제된 효소는 $L-galactono-{\gamma}-lactone$를 최적 기질로 사용하였으며 $35^{\circ}C$에서 pH 7.8일때 최적활성을 나타내었다. 본 연구에서 정제된 효소는 산소를 전자수용체로 하는 $L-galactono-{\gamma}-lactone$ oxidase임을 알 수 있었다.

• 한국수산과학회지
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• 제29권3호
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• pp.309-319
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• 1996

어체 중에 분포하는 단백질분해효소를 어류가공 부산물의 회수 이용 측면에서 검토코자 혈합육어 (멸치와 전어)와 백색육어 (농어와 도다리)의 육과 내장에서 추출한 조효소에 대하여 식염농도의 차이가 활성에 미치는 영향, 그리고 진공동결건조와 glycerol의 혼합이 저장 중 단백질분해능에 미치는 영향 등에 관하여 검토하였다. 그리고 멸치의 육과 내장 단백질분해 조효소에 대하여는 효소작용 시간별로 방어근원섬유단백질의 분해 생성물에 대한 Sephacryl S-100 gel chromatography 및 $C_{18}$ reversed phase HPLC chromatography분석도 병행하였다. 육에서 추출한 단백질분해 조효소는 casein과 방어 근원섬유단백질 기질에 대하여 식염농도의 증가와 더불어 효소활성의 저해도 증대하였으며, 효소활성의 저해도는 방어근원섬유단백질에 비하여 casein기질에서, 혈합육어 단백질분해 조효소보다는 백색육어의 단백질분해 조효소에서 더욱 현저하였다. 내장에서 추출한 단백질분해 조효소의 경우, 혈합육어 단백질 분해 조효소는 식염농도의 차이에 의하여 효소활성에 미치는 영향이 적었으나 백색육어의 단백질분해 조효소는 활성의 현저한 저하를 초래하였다. 전어와 농어의 육 및 내장 단백질분해 조효소의 활성에 미치는 동결건조 및 glycerol혼합에 의한 영향을 저장중에 비교한 결과, 기질의 종류에 따라 차이가 있었지만, 전어의 육과 내장 단백질분해 조효소에 비하여 농어의 육과 내장 단백질분해 조효소가 훨씬 불안정하였다. 멸치육과 내장 단백질분해 조효소의 방어근원섬유 단백질에 대한 가수분해작용은 반응초기에 신속히 진행되었고, 가수분해물의 생성량은 첨가된 단백질분해 조효소의 비율에 따라 규칙적으로 증가하였다. 그리고, 효소작용에서 생성한 가수분해물을 분석한 결과, 효소작용시간의 경과와 더불어 세분화된 획분의 종류와 양이 점차 증가하였으며, 이 같은 경향은 근육 단백질분해 조효소에 비하여 내장 단백질분해 조효소에서 더욱 현저하였다. 이 결과는 효소분해생성물의 종류와 양이 규칙적으로 분해되어 일정한 분해생성물이 증가하여 가는 것을 암시하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제37권2호
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• pp.206-213
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• 2005

본 연구에서는 32종 생약재로부터 70% 에탄올과 물 추출물을 제조하고, 이들의 항균, 항곰팡이, 항암, 항고혈압활성을 조사하였다. 생약재외 추출물 제조는 32종의 생약재를 100에서 2시간동안 추출한 후 동결 건조하였다. 항균활성은 6종의 병원성 미생물을 사용하여 32종 생약재의 물 추출물과 70% 에탄올추출물에 대해 조사하였다. 그중 가자의 물 추출물과 70% 에탄올 추출물을 $125{\mu}g$ 첨가했을 때 14mm 이상의 항균 억제환을 나타내어 가장 좋은 항균활성을 보였다. 항곰팡이 활성은 5종의 곰팡이를 사용하여 32종 생약재의 물 추출물과 70% 에탄올추출물에 대해 paper disc확산법으로 조사하였다. 그 결과 계피의 70% 에탄올추출물을 $1000{\mu}g$ 첨가했을 때 10mm이상의 항균 억제환을 보여 가장 좋은 항곰팡이 활성을 나타내었다. 32종의 생약재 물 추출물과 70% 에탄을 추출물에 대한 ACE저해 활성을 조사하였다. 그 결과 파고지의 물 추출물이 10mf/mL의 농도에서 65.2%의 억제율을 나타내었으며, 파고지의 물 추출물로부터 sephacryl S-300 컬럼으로 분획한 Fr I의 분획물이 5mg/mL의 농도에서 81.1%의 억제율을 나타내었다. 생약재의 물 추출물과 70%에탄올 추출물의 세포독성을 조사하였다. 선정된 6종의 생약재중 정향의 에탄올 침전분획이 암세포에 대해 가장 우수한 세포독성을 나타내었다.

• Preventive Nutrition and Food Science
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• 제8권1호
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• pp.29-35
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• 2003

A crude polysaccharide fraction (GU-3) from the roots of Glycyrrhiza uralensis (licorice root), a screened herbal plant used in the preparation of herbal kimchi, enhanced Peyer's patch mediated bone marrow cell proliferation and NK cell-mediated tumor cytotoxicity against Yac-1 cells. GU-3 was further purified by DEAE-Sepharose CL-6B yielding fractions designated as GU-3I, and 3IIa∼3IIe. GU-3IIa is mainly composed of arabinose, galactose and galacturonic acid, and showed the highest bone marrow cell proliferation activity. In addition, GU-3IIb had arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid as the component sugars with a small quantity of protein; GU-3IIb also enhanced activity of NK cell-mediated tumor cytotoxicity. After these fractions were further fractionated via gel filtration on Sepharose CL-6B or Sephacryl S-300, two immunological active polysaccharides, GU-3IIa-2 and 3IIb-1 were purified from the respective fractions. GU-3IIa-2 mostly contained neutral sugars (75%) such as arabinose and galactose (molar ratio; 1.0 : 0.7) in addition to a considerable amount of galacturonic acid (20%), whereas GU-3IIb-1 was composed of arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid (molar ratio; 0.3 : 0.5 : 0.1 : 1.0). Methylation analysis indicated that GU-3IIa-2 was composed mainly of terminal, 4- or 5-linked and 3,4- or 3,5-branched arabinose, 3-linked, 4-linked and 3,6-branched galactose, and terminal and 4-linked galacturonic acid whereas GU-3IIb-1 contained various glycosidic linkages such as terminal and 4- or 5-linked arabinose, 2,4-branched rhamnose, terminal and 4-linked galactose, and terminal and 4-galacturonic arid. Single radial gel diffusion indicated that only GU-3IIa-2 strongly reacted with β-D-glucosyl-Yariv antigen. These results suggest that bone marrow cell proliferating activity and enhancement of NK cell-mediated tumor cytotoxicity of GU-3 are caused by polysaccharides containing a pectic arabinogalactan (GU-3IIa-2) and pectic polysaccharide (GU-3IIb-1).

• 한국식품영양과학회지
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• 제31권3호
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• pp.527-533
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• 2002

전통차 제조용 식물 63종을 대상으로 macrophage lysosomal enzyme activity를 검색한 결과, 홍화 냉수 추출물에서 높은 macrophage lysosomal enzyme 활성 (219%)을 발견하여 냉수 추출물 CT-0 획분에 대하여 metahnol 환류, ethanol 침전, 투석, 동결건조를 실시하여 macrophage lysosomal enzyme 활성이 더욱 증가된(227%) 고분자 획분 CT-1을 얻었다. 이 획분의 macrophage활성화 성분의 본체를 파악하기 위하여 pronate처리에 의한 단백질 분해와 periodate를 이용한 당 부위의 선택적 실활 후 활성을 검토한 결과, pronase를 처리한 CT-1에서는 약 8% 정도의 활성 증가를 보인반면 periodate 산화물에서는 활성이 약 8% 정도 감소되는 것으로 보아 홍화로부터 macrophage 활성을 나타내는 냉수 추출물의 활성 본체는 다당임을 알 수 있었다. 조다당 활성획분에 대하여 anion exchange column chromatography를 실시하여 9개의 획분(CT-1-I~CT-1-VIII)을 얻었으며 수율과 활성이 가장 높은 CT-1-IIa 획분을 Sepharose CL-6B 및 Sephacrl S-200의 gel permeation chromatography를 수행하여 주요 활성 다당인 CT-1-IIa-2-1을 최종적으로 정제하였다. HPLC상에서 순수한 단일 peak로 확인된 CT-1-IIa-2-1은 분자량이 68 kDa정도의 다당인 것으로 나타났고 macrophage의 lysosomal enzyme 활성은 대조군을 100%로 비교했을 때 243%를 나타내었다. 또한 구성당의 조성은 xylose(27.4%), arabinose(16.1%), mannose(15.9%), glucose(14.5%)의 순이었다. 본 연구에서 CT-1-IIa-2-1은 macrophage의 면역활성을 증가시키는 물질임이 확인되었으나 mouse를 대상으로 급성독성 검사를 실시한 결과 LD$_{50}$값이 397mg/kg으로 일정 농도 이상의 고농도에서는 독성을 나타냈다. 따라서 본 시료에 대하여 아만성.만성 독성과 유전 및 면역 독성과 같은 구체적인 독성 검사를 실시하여 안전농도를 산출한다면, 면역증강물질로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권2호
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• pp.130-139
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• 2016

지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 지질을 가수분해하는 활성이 높은 미생물을 선발하였으며, 동정하여 Aeromonas hydrophila PL43으로 명명하였다. A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제는 황산암모늄 침전, DEAE-sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose S-300HR 겔 크로마토그래피 단계로 수행하였으며 최종적으로 정제한 지질분해 효소는 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)를 기질로 사용했을 때, 84.5배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 3.7%이었다. p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 기질로 사용했을 때에는 56.6배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 2.5%이었다. SDS-PAGE를 수행한 결과, A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해효소의 분자량은 약 74 kDa으로 추정되었다. 지질분해 효소의 pH에 대한 영향은 pNPB와 pNPP 기질에서 pH 8.0에서 최대활성이 보였고 pH 7.0−10.0에서 안정하였다. pNPB를 기질로 사용한 경우에는 50℃에서 pNPP를 기질로 사용한 경우는 60℃에서 최대 활성을 나타냈으며, 정제한 지질분해 효소는 20−60℃에서 안정성을 나타내었다. 정제한 지질분해효소는 금속이온 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺에 의해서 효소활성이 억제되었으며, EDTA의 metal chelating에 의해 활성이 회복되었다. Inhibitor에 의한 저해는 효소 활성부위의 serine 잔기와 결합하여 효소 활성을 억제하는 PMSF에서 가장 우수하였으며 효소 활성부위의 aspatyl 잔기에 결합하여 효소활성을 억제하는 pepstatin A는 농도가 높아짐에 따라 효소활성을 저해하였다. 따라서 정제한 지질분해 효소는 활성부위에 serine 잔기와 aspartyl 잔기가 있는 것으로 사료되었다. 정제한 지질분해 효소의 K_m 값과 V_max 값은 pNPB를 기질로 사용 했을 때 K_m 값과 V_max 값은 1.07 mM과 7.27 mM/min이고, 기질이 pNPP일 때 K_m 값과 V_max 값은 1.43 mM 과 2.72 mM/min이었다.

• 한국식품과학회지
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• 제27권5호
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• pp.716-723
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• 1995

갈조류인 한국산 곰피(Ecklonia stolonifera)에서 fucoidan을 추출 정제하여 분자 구조적 특성을 조사하고 항혈액 응고 활성을 측정하였다. 건조곰피 20.0kg을 $100^{\circ}C$에서 2시간동안 2회 열수 추출하고 ethanol로 침전시켜 crude fucoidan 151.1g을 얻었다. Crude fucoidan을 염화칼슘과 cetyl pyridium chloride(CPC)로서 정제하여 Fucoidan-1을 얻었고 수율은 35.2%였다. 이 Fucoidan-1을 여러조건하에서 DEAE-Toyopearl 650 M 이온교환 chromatography법을 이용하여 정제한 결과 cellulose acetate 막 전기영동상에서 하나의 band를 나타내는 순도가 높은 곰피 Fucoidan-5을 얻었으며 dextran을 표준품으로 gel filtration chromatography를 행한 결과 분자량은 21,000∼23,000이었다. 곰피 Fucoidan-5의 구성당은 fucose 35.7%와 galactose 4.3%이였고, fucose와 황산기의 mole 비는 약 1 : 1이었다. 적외선 흡수 spectrum 에서 $1240\;cm^{-1}$와 $850\;cm^{-1}$ 부근에서 흡수가 확인되었으며 비선광도가 $-127.2^{\circ}$인 것으로 보아 황산기는 주로 ${\alpha}-L-fucose$의 4번 위치의 탄소에 결합되어 있는 것으로 추정할 수 있었다. 또한 곰피 Fucoidan-5를 methyl화하여 가수분해하고 methyl alditol acetate를 만든 후 gas chromatography를 행한 결과 Fucoidan-5는 주로 황산기를 C4에 가진 fucose가 ${\alpha}l-2$결합 또는 ${\alpha}l-3$결합으로 이루어진 다당류임을 추정할 수 있었다. 곰피 Fucoidan-5의 항 thrombin 활성은 heparin(140 units/mg)의 약 1.4배이었다. 이상의 결과에서 CPC법과 이온교환 chromatography법을 사용하여 갈조류인 곰피로부터 분리 정제한 곰피 Fucoidan-5는 순도가 높은 fucoidan임을 알 수 있었고 수율은 28.1%였다.