Purification and Characterization of a Lipolytic Enzyme Produced by Aeromonas hydrophila PL43

A bacterial strain, producing an excellent lipolytic enzyme, was isolated from the intestinal tracts of an earthworm (Eisenia fetida). The strain was identified as Aeromonas hydrophila by phenotypic, chemotaxonomic characteristics and 16S ribosomal DNA analysis, and was designated as Aeromona hydrophila PL43. The lipolytic enzyme from A. hydrophila PL43 was purified via 35−45% ammonium sulfate precipitation, DEAE-sepharose fast flow ion-exchange, and sephacryl S-300HR gel filtration chromatography. The yield of the purified enzyme was 3.7% and 2.5% of the total activity of crude extracts with p-nitrophenyl butyrate (pNPB) and p-nitrophenyl palmitate (pNPP) as substrates, respectively. The molecular weight of the purified enzyme was approximately 74 kDa using gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and zymography. The optimal activity of purified enzyme was observed at 50℃ and pH 8.0 using pNPB, and 60℃ and pH 8.0 using pNPP. The purified enzyme was stable in the ranges 20− 60℃ and pH 7.0−10.0. The activity of purified enzyme was inhibited by PMSF, pepstatin A, Co²⁺, Cu²⁺, and Fe²⁺, but was recovered by metal chelating of EDTA. The K_m and V_max values of the purified enzyme were 1.07 mM and 7.27 mM/min using pNPB and 1.43 mM and 2.72 mM/min using pNPP, respectively.

Aeromonas hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제 및 특성

지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 지질을 가수분해하는 활성이 높은 미생물을 선발하였으며, 동정하여 Aeromonas hydrophila PL43으로 명명하였다. A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해 효소의 정제는 황산암모늄 침전, DEAE-sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose S-300HR 겔 크로마토그래피 단계로 수행하였으며 최종적으로 정제한 지질분해 효소는 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)를 기질로 사용했을 때, 84.5배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 3.7%이었다. p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 기질로 사용했을 때에는 56.6배로 정제되었고 효소 활성의 회수율은 2.5%이었다. SDS-PAGE를 수행한 결과, A. hydrophila PL43이 생산하는 지질분해효소의 분자량은 약 74 kDa으로 추정되었다. 지질분해 효소의 pH에 대한 영향은 pNPB와 pNPP 기질에서 pH 8.0에서 최대활성이 보였고 pH 7.0−10.0에서 안정하였다. pNPB를 기질로 사용한 경우에는 50℃에서 pNPP를 기질로 사용한 경우는 60℃에서 최대 활성을 나타냈으며, 정제한 지질분해 효소는 20−60℃에서 안정성을 나타내었다. 정제한 지질분해효소는 금속이온 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺에 의해서 효소활성이 억제되었으며, EDTA의 metal chelating에 의해 활성이 회복되었다. Inhibitor에 의한 저해는 효소 활성부위의 serine 잔기와 결합하여 효소 활성을 억제하는 PMSF에서 가장 우수하였으며 효소 활성부위의 aspatyl 잔기에 결합하여 효소활성을 억제하는 pepstatin A는 농도가 높아짐에 따라 효소활성을 저해하였다. 따라서 정제한 지질분해 효소는 활성부위에 serine 잔기와 aspartyl 잔기가 있는 것으로 사료되었다. 정제한 지질분해 효소의 K_m 값과 V_max 값은 pNPB를 기질로 사용 했을 때 K_m 값과 V_max 값은 1.07 mM과 7.27 mM/min이고, 기질이 pNPP일 때 K_m 값과 V_max 값은 1.43 mM 과 2.72 mM/min이었다.