Rhodotorula glutinis 배양균체에 합유되어 있는 glutathione을 회수키 위히여 본 연구에서는 열수 처리, acetone 처리, 초음파처리, 황산처리, 초산처리를 한 결과 열수처리와 초음파처리시 효과가 가장 양호하였으며 두 가지 방법을 병용하여 추출한 glutathione 함유액은 229 $\mu\textrm{g}$/ml였다. 또 paper chromatography로 추출하여 glutathione 을 확인하였다.
Coupled transcription/translation cocktail을 이용하여 R. glutinis EH 유전자를 in vitro에서 합성하고 활성을 평가하였다. SDS-PAGE 및 immunoblotting을 통하여 45 kDa 크기의 EH 단백질이 발현되었음을 확인하였고, NBP assay 및 chiral GC 분석을 통해 발현된 단백질이 (R)-styrene oxide에 대한 입체선택성이 있음을 확인하였다. 따라서 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 입체선택성을 유지시킨 EH 유전자 발현이 가능하며, 이러한 방법은 putative EH 유전자 탐색 등에 효율적으로 응용될 것이다.
Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (EH) 유전자를 pPICZ vector에 이중발현 cassette로 재조합하여 발현시킨 재조합균주 Pichia pastoris를 제작하였으며 라세믹 styrene oxide 혼합물로부터 고순도 광학활성 (S)-styrene oxide를 제조하는데 사용하였다. 본 연구에서 사용된 R. glutinis EH 유전자는 전보에서 사용한 pPICZ B/RgEH plasmid DNA를 주형으로 하여 얻었으며 PCR 방법으로 BglII 제한자리를 돌연변이 시키고 AOX1 promoter $(P_{AOX1})$-RgEH 유전자-전사종결서열($TT_{AOX1}$)을 이중으로 가진 이중발현 cassette를 만들어 P. pastoris의 염색체 DNA에 삽입시켰다. 반응온도를 $30^{\circ}C$로 하였을 때, RgEH를 이중발현 cassette로 발현시킨 재조합균주 P. pastoris의 (R)-styrene oxide에 대한 $V_{max}$ 값은 $2.2{\mu}mol\;min^{-1} (mg\;dcw)^{-1}$으로 단일발현 cassette로 발현시킨 P. pastoris의 $0.4{\mu}mol\;min^{-1}(mg\;dcw)^{-1}$에 비하여 6배 향상되었다. 광학순도가 높은 (S)-styrene oxide를 제조하는 최적조건을 찾기 위하여 입체선택적 가수분해 속도 및 수율에 미치는 detergent 및 온도의 효과를 실험하였으며, Tween 20을 0.5% 첨가하고 $10^{\circ}C$로 반응시킨 경우 10분 반응을 통해 99.9% ee 이상의 고순도 (S)-styrene oxide를 43.4% 얻을 수 있었다.
1976年 3月부터 1977年 2月까지 滿 12個月동안 榮山江 汽水域 39個 場所로부터 採水한 156個 water sample로서 酵母의 季節的 分布와 度包配에 따른 이들 酵母의 分布型을 調査하였다. 酵母의 全體 平均値는 100ml당 52에서 487個의 生菌數를 보여주었고 가장 많은 個體數는 春季에 있었고 가장 적은 個體數는 夏季에 있었다. 14屬 83種에 해당하는 933個의 酵母와 한 種의 酵母樣 곰팡이가 分離되었는데 基中 Candida가 29%, Debaryomyces가 17.3%, Rhodotorula가 16%, Saccharomyces가 14%이었고 나머지 다른 屬들은 10%以內이었다. Debaryomyces hansenii와 Rhodotorula glutinis가 全水域에서는 물론 年中 優點種이었고 총 好氣性細菌集團의 크기, 陸水流入量, 그리고 몇가지 지형적 기후적 요소들이 汽水환경에서 酵母의 季節的 分布는 물론 種의 組成을 反映하는 같다. 酵母의 平均數, 種의 多樣性 特히 醱酵性 및 爲菌系形成 母酵들의 數는 감度가 감소함에 따라 增加한 反面 질산염 利用酵母들은 위와 相反된 경향을 보여주었는데 이는 汽水域에서 酵母의 分布型을 認識하는데 감度勾配가 바람직한 看破 요소로서 利用될 수 ㅣ있음을 시사하고 있다.
Epoxide hydrolase(EH) catalyze the enantioselective hydrolysis of racemic epoxides to corresponding diols. A recombinant Pichia pastoris with EH from Rhodotorula glutinis has been constructed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR). The recombinant biocatalyst enantioselectively hydrolyze (R)-styrene oxide faster than (S)-enantiomer. The catalytic activity of recombinant biocatalyst was 7-fold higher than that of wild-type strain. The recombinant EH biocatalyst can be used for kinetic resolution for the production of enantiopure styrene oxide.
The yeast population on 14 species of seaweeds and in water estimated by cultural mothods over a 5-month period in south-west in Korea, Nine species of yeasts, comprising unidentified one, and one of yeast-like fungi were identified. Fifty phycase were attributed to the difference of cultural method between the present work and earlier repoeters and, to some exent, the higher number of Rhodotorula glutinis which had a prior adaptation to the release of inhibitory polyphenolic materials. Although, to what extent, all division of algae showed a similar variation in yeast population, correlated with month, the rapid decrease of yeast population in August seems to be the cause of exposure of heat irradiation in this month. The cultural estimate of per se fltration without double filter and one of unidentified species are discussed.
본 연구는 사료 내 Rhodotorula glutinis(Gluti- nicus) 효모의 첨가가 계란의 생산성, 난각 및 난황 색도에 미치는 영향을 구명하고자 72주령의 갈색 산란계 ISA Brown 360수를 공시하여 control, $\beta$-carotene 25ppm, 0.5%, 1%, 2% 그리고 4% Glutinicus로 처리하여 시험하였다. 각각의 처리구는 3반복, 반복당 20수씩, 한 케이지당 2수씩 배치하여 6주간 사양시험을 실시하였다. Glutinicus 첨가구 중 0.5% 수준(p<0.05)에서 사료요구율(FCR)과 계란 생산성 개선이 유의하게 나타났으며 연파란 발생율은 Glutinicus 첨가량 수준이 증가함에 따라서 감소하였다. 난각 강도는 Glutinicus 4% 첨가 시에 가장 높았으며, 난황 색도는 Glutinicus가 증가함에 따라서 2% 첨가까지 점차적으로 증가하였지만 Glutinicus 4% 첨가구와 2% 첨가구와는 유의적으로 차이가 없었다. 결론적으로 Glutinicus 0.5% 첨가가 계란 생산성을 증진시킬 수 있고, 난황 착색을 위해서는 Glutinicus 2% 첨가가 효과적이었다.
진균의 phenylalanine ammonia-lyase(PAL)와 식물의 PAL간 그리고 PAL과 histidine ammonia-lyase (HAL)간의 구조적 특성 관계에 대한 이해를 얻기 위해 옥수수병원균인 깜부기균(Ustilago maydis)의 PAL에 대한 면역학적 분석을 수행하였다. 진균의 PAL 항체와 식물의 PAL 항체를 이용하여 분석하였을 때 실험한 모든 종의 PAL 간에 교차반응이 나타났다. 알팔파 PAL 항체와 포플라 PAL 항체 모두 식물 PAL은 강하게 인식하였으나 진균의 PAL은 약하게 인식하였다. U. maydis PAL은 Rhodotorula glutinis 효모의 PAL만 약하게 인식하였다. U. maydis PAL은 식물의 PAL에 대해서 낮은 친화성을 보였으나 Pseudomonas 세균의 HAL에 대해서는 강한친화성을 보였다. 2종의 식물 PAL 항체들 또한 Pseudomonas 세균의 HAL에 대해 강한 친화성을 보였다. 진균과 식물의 PAL 항체는 PAL 효소의 활성 저해를 나타냈으며 세균의 HAL 효소의 활성에 대해서도 중도적 저해를 나타냈다. 세균의 HAL 항체는 식물과 효모와 Ustilago PAL 중에 Ustilago PAL 활성만 저해하였다. 식물의 PAL과 진균의 PAL 모두 효모의 PAL 활성은 저해하지 못했다. 본 연구는 PAL과 HAL간에 면역학적 관계가 있음을 처음으로 보고한다.
개량식 고추장으로부터 동정한 효모들은 Candida glabrata C. guilliermondii. C. humicola. C. rugosa, C. zeylanoides, Cryptococcus uniguttulatus, Pichia farinosa, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae Zygosaccharomyces rouxii로 분류되었다. 재래식 고추장에서 동정한 효모는 C. glabrata, P. farinosa, S. cerevisiae, Z. rouxii로 분류되었으며 분포율이 높아 발효숙성에 깊이 관여할 것으로 생각되는 효모는 재래식과 개량식고추장에서 Candida, Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces등 4속이었다. 개량식 고추장의 발효숙성 중기와 후기에 나타난 Z. rouxii와 S. cerevisiae는 고추장용 메주에서 분리되어 그 기원이 되는 것으로 생각되며, 특히 Z. rouxii는 고추장용 메주에서 분포된 효모중 46%를 차지하였다. 발효숙성중 분포는 Z. rouxii가 15일 후에 33%, S. cerevisiae가 21일 후에 13%펄 각각 가장 높은 분포율을 보였다. Candida속의 경우 개량식 메주, 소맥코지, 콩코지 모두에서 분리되었으나 고추장의 발효숙성이 진행됨 에 따라 40%에서 10%로 점차 감소하는 경향을 보였다. 재래식 고추장에서는 발효음성 3개월 후에 Z. rouxii가 53%, 7개월 후에 S. cerevisiae가 26%로 가장 높은 분포율을 보였다. NaCl 과 glucose를 혼용한 배지에서 S. cerevisiae와 Z. rouxii 등 2종의 효모가 다른 효모에 비해 생육이 현저히 나타난 것은 이들이 고추장의 발효숙성 과정에서 분리된 빈도수가 높았다는 것과 무관하지 않을 것으로 사료된다. 특히 S. cerevisiae와 Z. rouxii 두 균주는 무염 또는 7% NaCl이 첨가된 배지에서 가장 먼저 가스를 생성하였으며 7% NaCl이 첨가된 조건하에서의 가스생산량은 Z. rouxii 및 S. cerevisiae 각각에서 0.024 ml/ml/hr, 0.013ml/ml/hr로 나타났다.
국내 자연환경의 효모 균총을 확인함으로써 유용한 효모자원을 확보하기 위한 연구의 일환으로 대전 계족산, 충남 오서산 그리고 전북 백암산 지역에 서식하는 야생화들을 채집하여 이들로부터 효모들을 분리, 동정하였다. 대전의 계족산에서 수집한 야생화로부터는 10종에 속하는 12균주의 효모들을 분리하였고, 충남의 오서산에서 수집한 야생화로부터는 10종의 효모들 17균주를 분리하였다. 또한 전북 백암산의 야생화로부터 모두 24종에 속하는 38균주의 효모들을 분리하였다. 계족산, 오서산, 그리고 백암산에서 모두 발견된 효모는 Cryptococcus 속, Pseudozygoma 속, Rhodotorula 속, Sporobolomyces 속에 속하는 9종의 효모들이었다. 특히 3개 지역에서 수집한 야생화들로부터 Cryptococcus 속에 속하는 Cryptococcus aureus만이 모두 분리되었는데, 이 결과는 각 지역마다 독특한 효모 다양성을 보이고 있음을 시사하는 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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