• The Plant Pathology Journal
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• 제40권4호
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• pp.408-413
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• 2024

The emergence of rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) poses a significant threat to global cereal crop cultivation, necessitating the urgent development of reliable detection and quantification techniques. This study introduces a reliable approach for the precise and sensitive quantification of the RBSDV in cereal crop samples, employing a reverse transcription digital polymerase chain reaction (RT-dPCR) assay. We assessed the specificity and sensitivity of the RT-dPCR assay proposed for precise RBSDV detection and quantification. Our findings demonstrate that RT-dPCR was specific for detection of RBSDV, with no cross-reactivity observed with other viruses infecting cereal crops. The RT-dPCR sensitivity was over 10 times that of RT-quantitative PCR (RT-qPCR). The detection limit of RT-dPCR was 0.096 copies/㎕. In addition, evaluation of RT-dPCR assay with field samples was conducted on 60 different cereal crop samples revealed that RT-dPCR (45/60) exhibited superior accuracy compared with RT-qPCR (23/60). In this study, we present a specific and accurate RT-dPCR assay for the detection and quantification of RBSDV.

• 한국양식학회지
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• 제10권2호
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• pp.171-178
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• 1997

Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)는 치어에 감염되어 치명적인 질병을 유발하는, 양식산업에 있어 중요한 어류 병원체이다. 본 연구에서는 IPNV를 신속, 정확하게 진단하는 방법을 개발하고자 IPNV의 항원성 단백질인 VP2 유전자 부분에서 선택한 primers를 이용하여 역전사-중합효소연쇄반응법(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 실시하였다. RT-PCR 증폭법으로 순수분리도니 IPNV dsRNA 40 ng 정도의 적은 양도 확인 할 수 있었으며, IHNV와 같은 다른 어류 병원체의 게놈을 RT-PCR templates로 사용하였을 경우는 어떠한 PCR 산물도 검출되지 않는 특이성을 보였다. 특히 유전자의 분리없이 조직 그 자체를 대상으로 RT-PCR을 행하는 in situ RT-PCR 방법으로 IPNV가 감염된 넙치 (Paralichthy olivaceus) 치어의 조직에서 IPNV 감염을 신속하게 확인할 수 있었다. 따라서 RT-PCR 및 in situ RT-PCR 방법은 IPNV를 신속, 정확하게 진단하는데 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

• 대한환경공학회지
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• 제29권8호
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• pp.904-908
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• 2007

병원성 원생동물인 지아디아 람블리아는 수인성 질병을 야기하는 주요 원인이 되고 있다. 본 연구는 PCR 및 RT-PCR 기법을 적용하여 한강본류 하천수 시료에서 사람감염성 종인 지아디아 람블리아를 동정하고, 활성 여부를 판별하여 현 표준시험방법을 보완하고자 하였다. PCR과 RT-PCR에는 지아디아의 복부 흡반 구성 유전자를 증폭하는 giardin primer를 사용하였으며, DNA/RNA 추출 및 PCR/RT-PCR 과정에서의 민감도 검사를 수행한 결과, 1포낭까지 검출가능한 것으로 나타났다. 또한 한강본류 및 유입지천 시료 48점에 적용하여 면역형광항체법과 PCR 및 RT-PCR 방법을 비교하였다. 면역형광항체법을 이용한 현미경관찰 결과 48개 시료의 지아디아 총포낭수의 평균 농도는 6.3 cysts/10 L이었고 양성율은 62.5%였으며, 속빈 포낭을 제외한 지아디아의 평균 농도는 4.5 cysts/10 L이었고 양성율은 52.1%였다. PCR 수행결과 48개 시료 중 24개(50%)의 시료에서 지아디아 람볼리아가 검출되었으며, RT-PCR 수행결과 10개(21%) 시료가 살아있는 G. lamblia를 포함한 것으로 나타났다. 본 연구를 통해 PCR/RT-PCR 기법이 지아디아 포낭을 저농도로 포함하고 있는 하천수 시료에 적용가능하며 원생동물 표준시험방법을 보완하여 종(species) 및 활성에 대한 정보를 제공할 수 있을 것으로 결과되었다.

• 식물병연구
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• 제27권3호
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• pp.120-127
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• 2021

식물 바이러스는 작물 수확량에 상당한 손실을 일으키고 작물 생산을 지속적으로 위협하여 세계 식량 안보에 심각한 위협이 된다. 그 중 tomato spotted wilt virus (TSWV)는 주로 원예작물을 감염시키는 가장 위협적인 식물 바이러스로 넓은 기주 범위를 가진다. Reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR)은 TSWV의 민감한 검출을 위해 널리 사용되고 있지만 표준화의 어려움으로 인해 유용성이 감소한다. 따라서 본 연구에서는 TSWV 검출을 위해 민감하고 정확한 reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction (RT-ddPCR)을 확립하였다. TSWV 검출에 대한 RT-qPCR 및 RT-ddPCR의 민감도를 비교하였고, TSWV에 대한 RT-ddPCR의 특이성 분석은 고추에서 주로 발생하는 바이러스 및 음성 대조군에서 특이성을 확인한 결과 증폭되지 않았다. RT-ddPCR 및 RTqPCR에 의해 측정된 TSWV의 선형회귀곡선은 모두 높은 선형성을 나타냈지만, RT-ddPCR 분석이 10배 이상 더 민감하고 더 낮은 TSWV의 copy 수를 검출할 수 있었다. 종합적으로, 우리의 연구 결과는 RT-ddPCR이 TSWV 검출에 대해 높은 민감도와 특이성을 제공하고 낮은 농도의 현장 시료에서 TSWV 검출하는 데 적합하다는 것을 보여준다.

• 생명과학회지
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• 제16권5호
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• pp.729-733
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• 2006

크립토스포리디움의 활성 및 감염성 판정을 위해 Direct RT-PCR, 세포배양 후 RT-PCR 및 면역형광염색법을 비교한 결과는 다음과 같다. 1) 크립토스포리디움의 HSP70 gene에 대해 direct RT-PCR한 결과, 민감도가 매우 높아 저농도로 존재하는 환경시료에서의 크립토스포리디움 활성을 모니터링하는데 장점이 있을 것으로 보이나, 감염성의 판정은 알 수 없으며, 정량화가 안되는 단점이 있었다. 2) ${\beta}-tubulin$ gene에 대해 RT-nested PCR을 한 결과 크립 토스포리디움의 난포낭이 $1{\times}10^4$ 세포수정도 되어야 검출이 되는 것으로 나타나 HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교할 때 10,000배 이상 민감도가 떨어지는 것으로 나타났다. 3) 세포배양 후 RT-PCR 또는 면역형광염색법을 이용할 경우에는 민감도가 direct RT-PCR보다 다소 떨어지는 단점이 있었으나 크립토스포리디움의 오염원이나 오염이 심한 지역의 감염성 조사에 적합할 것으로 나타났으나, 정량화가 필요한 경우에는 세포배양 후 면역형광염색법이 효과적일 것으로 나타났다.

• 식물병연구
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• 제10권1호
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• pp.53-57
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• 2004

CGMMV는 한국에서 수박의 주요 병원균이고, 수박 생산에 심각한 영향을 미친다. 이 연구에서는 박 종자의 CGMMV를 RT-PCR을 이용하여 신속하고 민감하게 검정하는 진단방법을 개발하였다. CGMMV-W의 외피 단백질 유전자 sequence에서 제작된 CGMMV에 특이적인 primer인 Wmfl과 Wmrl은 RT-PCR에 의해 420 bp의 증폭산물을 증폭하였다. RT-PCR에 의한 진단을 위하여 바이러스 추출과정을 간소화하고 종자 추출물의 반응 억제물질을 감소시키기 위해 ethanol 침전, double filtration, PEG 침전, phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 추출법을 비교하였으며 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의 한 추출법이 민감성이 강한 방법으로 선발되었다. RT-PCR을 위해 선발된 primer들과 추출법은 1,000립의 건전 종자에 1립의 이병 종자를 혼합한 수준까지 판별이 가능하였다. 신속하고 민감한 RT-PCR에 의한 본 검정방법은 높은 반응 억제물질을 함유하는 박 종자에서 CGMMV의 특이적인 진단을 위해 유용한 방법이다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제29권1호
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• pp.31-39
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• 2014

본 연구에서는 FCV 현탁액에 물리, 화학적 위생처리 후 복합효소처리라는 전처리과정을 적용한 뒤 real-time RT-PCR법을 이용하여 살균효능을 분석하였다. RT-PCR 이전에 $37^{\circ}C$에서 30분 동안 PK와 RNase A를 처리함으로써 UV, 열, 염소, 에탄올, 과초산계열 제품에 의해 불활성화 된 바이러스들은 음성 결과를 나타내었고, real-time RTP-CR법을 통해 살균 효능을 정량분석한 결과, 복합효소처리를 했을 경우 무처리구보다 더 높은 살균 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Nuanualsuwan S. 등의 선행연구에서와 같이 PK와 RNase A로 전처리하는 단계를 통하여 물리, 화학적 위생처리에 의해 손상되지 않은 바이러스가 RT-PCR법에 의해 증폭되는 것을 방지함으로써 Real-time PCR법에 대한 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, FCV를 검출하기 위해 사용된 RT-PCR과 real-time RT-PCR 두 방법 중에서도 real-time RT-PCR법이 가장 신속하면서도 민감도 높은 결과로 도출되었다. 따라서, 유전자 분석 이전에 복합효소처리는 물리, 화학적 위생처리에 의해 불활성화 된 바이러스의 RNA가 transcription 또는 증폭되는 것을 방지하기 위한 수단으로 real-time RT-PCR법과 결합됨으로써 노로바이러스를 비롯한 식중독 바이러스를 검출하는데 효과적으로 적용될 것으로 판단된다. 또한 식품현장에서 전기영동 과정없이 신속하게 살아있는 바이러스만을 수치적으로 정량화함으로써 식품안전에도 기여할 것으로 사료된다.

• 환경생물
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• 제22권2호
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• pp.329-335
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• 2004

To develop a biomarker for the monitoring of the contamination of estrogenic endocrine disrupters in the aquatic environment, reverse transcription -polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis of vitellogenin (Vg) mRNA expression was optimized in Bombina orientalis, a Korean red bellied toad species. Based on partial cDNA sequences of both Vg and beta actin genes of B. orientalis, specific primers for RT-PCR of Vg and beta actin mRNAs were developed. Semiquantitative RT-PCR of the Vg mRNA in liver was optimized using a beta actin mRNA as an internal control in both sexes. In female RT-PCR using $1\;\mu{g}$ of the liver cDNA resulted in a linear increment in the PCR product of Vg from 18 to 34 cycles of amplification. In male, on the contrary, the RT- PCR product was first detected at 30 cycles of amplification and a linear increment was observed from 30 to 40 cycles of amplification, suggesting that male B. orientalis expresses minute amount of Vg mRNA which is a $2^{-12}$ equivalent of female. In conclusion, the optimized protocol for semiquantitative RT-PCR analysis of Vg mRNA level in B. orientalis male liver will be useful for the environmental monitoring the xenoestrogen contamination in the freshwater environment in Korea.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제46권5호
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• pp.841-848
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• 2004

살균된 우유에 오염된 Salmonella의 신속한 검출 방법을 공중 보건의 보호를 위하여 중요하다. RT-PCR 방법은 생균과 사균을 분별하여 검출할 수 있는 분자유전학적 방법이다. 본 연구의 RT-PCR 방법은 Salmonella의 type 1 fImbriae의 단량체 단백질을 암호화하는 fimA 유전자의 mRNA를 주형으로 하여 DNA를 증폭하는 방법으로서 활력이 있는 Salmonella를 검출할수 있기 위하여 개발되었다. RNA 시료를 RQRNase-free DNase로 처리하여 오염된 DNA를 파괴하여 RT-PCR 반응에서 주형으로서 DNA가 합성되는 것을 방지할 수 있었다. 이 RT-PCR 방법은 Salmonella 7균주를 검출하였으나 Escherichia coli, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, 및 Klebsiella pneumoniae 는 검출하지 않았다. 우유 내에서 열처리된 $10^7/ml과 10^6/ml$ 세균수의 Salmonella는 검출되 었으나 $10^5{\sim}100/ml$는 검출되지 않았다. RT-PCR를 검출할 수 있는 활력이 있는 Salmonella의 최소 세균수는 100/ml이었다.

• 현장농수산연구지
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• 제5권1호
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• pp.57-63
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• 2003

The bovine rotavirus(BRV), bovine coronavirus(BCV) and bovine viral diarrhea virus(BVDV) are main viruses of bovine viral diarrhea disease. These viruses could be rapidly amplified by the reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR). This study was conducted to develop rapid and accurate diagnostic methods of these viral diseases by multiplex RT-PCR. Specific primers were designed based on the sequences reported by Chang KO et. al. (1997) and Schroeder BA, et. al. (1990), RNA were prepared from the cultured viruses, first-stranded DNAs were synthesised by reverse transcriptase. PCR were conducted to amplify specific regions of the viruses by multiplex. Three bands such as 1,062bp for BRV, 458bp for BCV, and 300bp for BVDV were successfully produced by multiplex RT-PCR. In conclusion, this result suggested that these viruses could be diagnosed rapidly and accurately by multiplex RT-PCR.