• Journal of Plant Biotechnology
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• 제32권3호
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• pp.167-173
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• 2005

본 연구는 고추열매의 capsaicinoid 생합성 조절 기작을 연구하고자 general phenylpropanoid pathway의 2번째 단계에 작용하는 것으로 알려진 3종류의 c4h cDNA clone을 확보하여 염기서열을 분석한 결과, pc4h1와 pc4h2의 크기는 각각 1,775 bp와 1,655 bp으로 505개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 암호하는 full length의 ORF를 갖추고 있었으나 pc4h3는 5'-말단의 coding 영역 일부가 소실 되었다. 이들은 공히 모든 cytochrome P450 효소에서 진화학적으로 보존되어 있는 3종류의 conserved region 즉 domain 1(proline-rich region), domain 2 (threonine-containing binding pocket for the oxygen molecule), 그리고domain 3(heme binding region)을 포함하고 있었으며 evolutionary tree분석을 통하여 pc4h1와 pc4h2는 모두 Class I에 속하는 것으로 서로 간에는 95.8%의 유사성을 나타내어 거의 동일한 유전자인 것으로 조사되었다. 특히 Class II로 분류된 Citrus sinensis C4H1과 Phaseolus vulgaris C4H와는 단지 64.9에서 64.5%의 homology를 나타내었다. 또한 pc4h2는 상처를 주지 않은 조직에서는 비교적 적은 양의 mRNA 발현수준을 보였으나 상처를 가한 후 6시간의 열매에서는 400%, 뿌리에서는 200%까지 그 발현 양이 증가하였다. 이와 유사하게 pc4h1의 전사량도 상처에 의하여 유도는 되나 basal level이 pc4h2보다 높아서 발현증가 비율은 그다지 높지 않았다. 반면에 pc4h3 유전자는 상처를 주지 않은 모든 조직에서 거의 발현되지 않았으며 상처에 의하여서도 전혀 반응을 하지 않았다.

• 생명과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1625-1630
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• 2008

본 연구는 생분해성 플라스틱인 poly-${\beta}$-hydroxybutyrate (PHB)의 생산단가를 낮추기 위한 노력으로 저가의 기질로부터 PHB 대량생산을 위한 기초자료를 얻는데 그 목적을 두었다. Hemicellulose hydrolysate는 지구상에 풍부하게 존재하는 저가의 waste by-product로서 xylose가 많이 포함되어 있다. 본 연구에서는 xylose로부터 PHB를 생산할 수 있는 균주를 토양에서 분리하여, 분류학적 위치를 밝히고, 균체 생육 최적 조건, PHB 생산을 위한 최적 발효 배양 조건, PHB의 구조 확인 등을 검토 하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 토양으로부터 분리한 균주 J-65는 형태학적, 배양적, 생화학적 및 partial 16S rRNA sequence에 근거하여 Bacillus megaterium로 동정하였다. B. megaterium J-65의 균체 생육 최적 조건은 온도 $37^{\circ}C$, 초발 pH 8.0이었으며 2% xylose, 0.25% $(NH_4)_2SO_4$, 0.3% $Na_2HPO_4{\cdot}12H_2O$, 0.1% $KH_2PO_4$였다. PHB 축적에 영향을 미치는 요인을 검토하기 위해 균체생육 최적배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간 1차 배양한 후, 균체를 회수하여 각종 영양분이 결핍된 배지에 2차 배양을 실시한 결과 B. megaterium J-65는 균형생육조건(balanced-growth condition)에서 PHB를 합성하는 균주로 나타났다. PHB보다 물성이 향상된 PHB/HV 공중 합체를 생산하기 위하여 보조기질로 propionic acid를 첨가하였을 때, 0.1% propionic acid 농도에서 HV mol%가 14%인 PHB/HV 공중합체가 합성되었다. 5 l 용량의 발효조에 B. megaterium J-65를 회분배양하였을 때 배양 21시간에 건조균체량 10 g/l, PHB 3.5 g/l를 얻을 수 있었고, 유가배양을 실시한 결과 배양 48시간에 건조균체량 26.52g/l, PHB 9.28 g/l를 얻을 수 있었다. 생산된 PHB를 alkaline solution 처리와 chloroform을 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출.정제한 후 Gas Chromatography로 정제를 확인하고 300MHz 1H-NMR을 실시한 결과 3-hydroxybutyrate의 homopolymer임을 확인하였다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제49권5호
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• pp.546-557
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• 2000

연구배경 : 결핵발병률과 다제내성 결핵균주의 증가로 효과적인 치료 및 관리를 위해 보다 신속하고 정확한 약제내성의 진단이 필요한 실정이다. 이에 다제내성 중요한 표지자인 rifampin 내성의 주요 기전인 rpoB 유전자 돌연변이 검출을 위해 기존의 직접 염기 서열분석과 최근 유전자 발현, 유전자 변이 및 다형성, 그리고 염기서열분석 등의 연구에 중요한 기술로 이용되어지는 oligonucleotide chip 기술을 이용하기 위한 간편하고 정확한 돌연변이 검출법을 개발하고자 시행하였다. 방법 : 본 연구에는 rifampin 내성 결핵 균주 28예와 10예의 감수성 균주 총 38예의 rifampin 내성 결해 균주를 선택하였고, wild type probe 6종류와 돌연변이 출현빈도가 높은 12종류의 probe를 제작하여 총 18 종류의 oligonucleotide probe를 고형지지체에 부착 시킨 저밀도 oligonucleotide chip을 제작하였으며 oligonucleotide chip을 이용한 rpoB 돌연변이 검출과 결과를 직접염기서열 분석 결과와 비교하였다. 결과 : Oligonucleotide chip 분석 결과 rifampin 감수성 균주에서 모두 각 codon의 wild type probe와 반응이 나타났으며, 내성 균주에서는 돌연변이가 나타난 codon을 제외한 codon 의 경우는 wild type probe와 반응이 일어났으며, 각 균주 별 돌연변이가 나타난 codon은 정확하게 그에 해당하는 돌연변이 probe와 반응함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 직접 염기 서열 분석 결과와 서로 일치함을 알 수 있었다. 또한 oligonucleotide chip 분석 결과와 염기서열 분석 결과에서 rpoB 유전자의 codon 531과 526에서 대부분 돌연변이가 검출되어 rpoB 유전자의 돌연변이 중 큰 비중을 차지함을 또한 알 수 있었다. 결론 : 결핵균의 rifampin 내성 획득에 중요한 기전인 rpoB 유전자의 돌연변이를 저밀도의 oligonucleotide chip을 이용하여 검출할 수 있었으며 향후 지속적인 개선에 의하여 항생제 내성 진단의 자동화를 위한 유용한 수단이 될 것으로 기대된다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제28권5호
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• pp.375-395
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• 2006

Purpose: Lingual nerve (LN) damage may be caused by either tumor resection or injury such as wisdom tooth extraction, Although autologous nerve graft is sometimes used to repair the damaged nerve, it has the disadvantage of necessity of another operation for nerve harvesting. Moreover, the results of nerve grafting is not satisfactory. The nerve growth factor (NGF) is well-known to play a critical role in peripheral nerve regeneration and its local delivery to the injured nerve has been continuously tried to enhance nerve regeneration. However, its application has limitations like repeated administration due to short half life of 30 minutes and an in vivo delivery model must allow for direct and local delivery. The aim of this study was to construct a well-functioning $rhNGF-{\beta}$ adenovirus for the ultimate development of improved method to promote peripheral nerve regeneration with enhanced and extended secretion of hNGF from the injured nerve by injecting $rhNGF-{\beta}$ gene directly into crush-injured LN in rat model. Materials and Methods: $hNGF-{\beta}$ gene was prepared from fetal brain cDNA library and cloned into E1/E3 deleted adenoviral vector which contains green fluorescence protein (GFP) gene as a reporter. After large scale production and purification of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, transfection efficiency and its expression at various cells (primary cultured Schwann cells, HEK293 cells, Schwann cell lines, NIH3T3 and CRH cells) were evaluated by fluorescent microscopy, RT-PCR, ELISA, immunocytochemistry. Furthermore, the function of rhNGF-beta, which was secreted from various cells infected with $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, was evaluated using neuritogenesis of PC-12 cells. For in vivo evaluation of efficacy of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus, the LNs of 8-week old rats were exposed and crush-injured with a small hemostat for 10 seconds. After the injury, $rhNGF-{\beta}$ adenovirus($2{\mu}l,\;1.5{\times}10^{11}pfu$) or saline was administered into the crushed site in the experimental (n=24) and the control group (n=24), respectively. Sham operation of another group of rats (n=9) was performed without administration of either saline or adenovirus. The taste recovery and the change of fungiform papilla were studied at 1, 2, 3 and 4 weeks. Each of the 6 animals was tested with different solutions (0.1M NaCl, 0.1M sucrose, 0.01M QHCl, or 0.01M HCl) by two-bottle test paradigm and the number of papilla was counted using SEM picture of tongue dorsum. LN was explored at the same interval as taste study and evaluated electro-physiologically (peak voltage and nerve conduction velocity) and histomorphometrically (axon count, myelin thickness). Results: The recombinant adenovirus vector carrying $rhNGF-{\beta}$ was constructed and confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequence analysis. GFP expression was observed in 90% of $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected cells compared with uninfected cells. Total mRNA isolated from $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected cells showed strong RT-PCR band, however uninfected or LacZ recombinant adenovirus infected cells did not. NGF quantification by ELISA showed a maximal release of $18865.4{\pm}310.9pg/ml$ NGF at the 4th day and stably continued till 14 days by $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected Schwann cells. PC-12 cells exposed to media with $rhNGF-{\beta}$ adenovirus infected Schwann cell revealed at the same level of neurite-extension as the commercial NGF did. $rhNGF-{\beta}$ adenovirus injected experimental groups in comparison to the control group exhibited different taste preference ratio. Salty, sweet and sour taste preference ratio were significantly different after 2 weeks from the beginning of the experiment, which were similar to the sham group, but not to the control group.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
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• pp.195-205
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• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제22권5호
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• pp.727-734
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• 2015

본 연구에서는 새로운 프로바이오틱스를 선발하고자 protease를 생산하는 GRAS균주를 된장 및 청국장으로부터 분리하고 그 특성을 조사하였다. 분리한 균주를 분리 동정한 결과 각각 B. amyloliquefaciens CDD5, B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3로 명명하였다. 분리균주의 생육은 12시간 배양 시, 7.13~7.32 log CFU/mL로 최대 생육도를 보였으며 24시간까지 유지되다가 감소하는 경향을 나타내었고, 그 중 B. amyloliquefaciens CGD3의 protease 활성이 9.21 U/mL로서 가장 높게 나타났다. B. amyloliquefaciens이 생산하는 protease 활성은 pH 7.0~10.0, 온도는 $50^{\circ}C$에서 최적활성을 나타내었으며, casein에서 protease활성이 가장 우수하게 나타났다. pH, NaCl, glucose 농도를 달리한 배양조건에 따른 B. amyloliquefaciens의 생육특성으로는 pH 5.0~10.0의 넓은 범위에서 생육하였고, NaCl은 12% 농도까지 증식하였으며 glucose 5%까지는 생육하나 10% 농도부터는 현저하게 생육이 낮아짐을 확인하였다. 또한 혈당저하를 유도하는 ${\alpha}$-glucosidase의 저해활성을 측정한 결과, B. amyloliquefaciens CPD4 및 B. amyloliquefaciens CGD3에서는 각각 96.65% 및 97.85%의 저해율을 나타내었다. 이러한 결과는 특히 protease활성이 가장 우수하고 ${\alpha}$-glucosidase 또한 높은 저해활성을 가진 B. amyloliquefaciens CGD3 균주의 생육특성을 고려하여 단백질 분해 분야의 프로바이오틱 적용 및 당뇨예방용 기능성식품 소재로의 가능성이 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제28권11호
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• pp.1347-1353
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• 2018

본 연구는 한국전통약용식물(구기자, 오미자 잎)의 발효물로부터 분리한 Bacillus coagulanse NRR1207의 발효 특성을 파악하고 Bacillus coagulans NRR1207의 ${\alpha}$-galactosidase의 활성과 이를 통한 대두박의 비소화성분의 분해를 확인하였다. Bacillus coagulans NRR1207이 생산하는 효소 중 ${\alpha}$-galactosidase, ${\beta}$-galactosidase, ${\alpha}$-glucosidase가 가장 높은 40 nmol 이상의 활성을 나타내었다. Bacillus coagulans NRR1207의 발효 특성은 10% skim milk에서 배양했을 때, pH는 급속히 감소했고 적정 산도는 1.9%까지 증가했고 생균수도 발효 24시간에 8.8 log CFU/ml로 증가했다. 유당은 배양 72시간째 완전히 고갈되었고 유산 생산 능력도 탁월했다. Bacillus coagulans NRR1207을 대두박에 접종 후 배양시간에 따른 생균수의 변화는 배양 시작 시 7.6 log CFU/ml, 배양 16시간에 최고에 도달하여 9.0 log CFU/ml이었고 배양 72시간에 8.3 log CFU/ml로 Bacillus coagulans NRR1207이 왕성하게 잘 성장하였다. 대두박의 비소화성분 분해는 Bacillus coagulans NRR1207 접종 후 발효 24, 48, 72시간이 경과하면서 이 균이 생산한 ${\alpha}$-galactosidase에 의해 비소화성분인 stachyose와 raffinose가 대부분 분해되고 galactose가 생성되었다. 따라서 Bacillus coagulans NRR1207은 대두박의 비소화성분을 분해하는 생균제(Probiotics)로써 이용하여 식품 및 가축 사료 이용성 증대에 활용이 가능할 것으로 사료된다.

• 한국버섯학회지
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• 제22권2호
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• pp.60-66
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• 2024

Cladobotryum mycophilum에 의해 발생하는 솜털곰팡이병은 양송이버섯 재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 솜털곰팡이병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물의 생물검정 및 적정배양 조건을 설정하였다. 재배중인 양송이버섯 배지에서 솜털곰팡이병 병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC7을 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC7균주는 Bacillus altitudinis로 동정되었다. B. altitudinis HC7을 양송이버섯에 처리한 결과 78.2%의 방제효과를 보였다. 따라서 B. altitudinis HC7이 양송이버섯 솜털곰팡이병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다. HC7균주의 생장온도는 25~35℃, pH는 6.0 이상에서 왕성한 생장을 보였다. 대량배양을 위한 효율적인 영양원 선발을 위하여 기본배지에 탄소원 fructose 등 18종, 무기질소원 NH4Cl 등 6종, 유기질소원 peptone 등 6종 그리고 아미노산 asparagine 등 11종을 각각 1%씩 첨가하였고, 무기염류 13종을 첨가하여 각각에 대한 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 선발된 각각의 영양성분들에 대한 최적 농도를 조사하기 위하여 각각의 성분을 최소 0.1%에서 최대 4.0%까지 배지에 첨가하여 배양 후 생장정도를 조사하였다. 대량배양을 위한 생육 조건은 온도 30℃, pH 6, 탄소원 3% Soluble startch, 유기질소원 10% Soytone, 무기질소원 1% (NH₄)₂HPO₄, 아미노산 0.5% Lasparagin 그리고 무기염류는 1.0 mmol KCl에서 왕성한 생장을 보였다.