• 미생물학회지
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• 제41권2호
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• pp.117-124
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• 2005

Rotifer와 병든 넙치 자어로부터 분리된 2개의 균주는 표현형적인 특성 확인 결과 Vibrio ichthyoenteri로 확인이 되었다. V. ichthyoenteri를 검출하기 위래 고감도 PCR 방법 개발을 하기 위래 V. ichthyoenteri 16S-23S rRNA intergenic spacer region(ISR)을 분석하였고, V. ichthyoenteri중 특이적 primer를 개발하였다. V. ichthyoenteri 의 ISR를 분석한 결과 1개의 다형성 ISR type서열을 포함하고 있었다. ISR서열은 길이는 348bp이며 tRNA gene을 가지고 있지 않았다. 이 서열을 가지고 이미 알려진 다른 Vibrio 종의 ISR 서열과 mutiple alignment를 수행한 결과 여러 영역에서 높은 가변성을 나타내어 가변 부위를 표적으로 하여 V. ichthyoenteri를 검출하기 위한 종 특이적 primer를 제작하였다. 제작된 primer의 특이성을 확인하기 위해 Vibrio 표준균주 19종의 genomic DNA와 분리균주 18 group에 genomic DNA 그리고 V. ichthyoenteri와 가장 유사한 서열을 가지고 있다고 알려진 Vibrio 종의 genomic DNA를 가지고 시험하였다. 그 결과 본 연구에서 제작된 종 특이적 primer를가지고 PCR 반응을 하면 V. ichthyoenteri를 검출 할 수가 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권6호
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• pp.812-822
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• 2014

Metagenomic analysis of the human intestinal microbiota has extended our understanding of the role of these bacteria in improving human intestinal health; however, a number of reports have shown that current total fecal DNA extraction methods and 16S rRNA universal primer sets could affect the species coverage and resolution of these analyses. Here, we improved the extraction method for total DNA from human fecal samples by optimization of the lysis buffer, boiling time (10 min), and bead-beating time (0 min). In addition, we developed a new long-range 16S rRNA universal PCR primer set targeting the V6 to V9 regions with a 580 bp DNA product length. This new 16S rRNA primer set was evaluated by comparison with two previously developed 16S rRNA universal primer sets and showed high species coverage and resolution. The optimized total fecal DNA extraction method and newly designed long-range 16S rRNA universal primer set will be useful for the highly accurate metagenomic analysis of adult and infant intestinal microbiota with minimization of any bias.

• 생명과학회지
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• 제24권4호
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• pp.361-369
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• 2014

16S rRNA gene PCR법은 환자 검체로부터 병원성 미생물을 검출 및 동정에 사용되어진다. 본 연구는 대량의 임상미생물 진단을 위해 bacterial 16S rRNA 부위 유전자 서열을 이용하여 광대한 범위와 높은 특이도를 가지는 primer을 포함한 PCR법을 개발하였다. 10개 표준 균주 16S rRNA 보존 부위의 유전자 서열을 기반으로 primer set를 구축하였다. 98명 환자 검체에서 임상 미생물을 분리하였다. 98개 균주는 phenotypic 방법을 이용하여 확인하고, 개발된 primer set와 universal primer set를 이용한 PCR법으로 확인하였다. 획득한 PCR 산물은 forward primer, reverse primer, 그리고 자동화 DNA 분석기를 이용하여 각 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 분석 및 확인하였다. 본 연구에서 개발된 primer set와 universal primer set의 임상미생물 검출에 대한 효율성을 평가하였고, 또한 phenotypic 방법과 분자생물학적 방법을 비교했다. 분리된 98개 균주를 대상으로 개발된 primer set로 16S rRNA PCR을 진행하여 778 bp 크기의 단일밴드로 증폭 되었음을 확인했다. 총 98개중 94개 균주(95.9%)는 phenotypic 결과와 동일함을 확인했다. 새로 개발된 primer set를 이용한 결과는 universal primer set를 이용한 98개 균주(100%)의 결과와 동일함을 확인하였다. 개발된 16S rRNA gene PCR법은 임상미생물 검출 및 동정에서 신속성, 정확성, 그리고 검사 비용 절감의 장점을 가진다. 개발된 primer set는 병원성 미생물 동정에서 효율성을 확인했다.

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.305-310
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• 2009

플라스미드 pGKV21에는 229-nt single-strand DNA initiation (ssi) signal이 존재한다. Asymmetric PCR 기법으로 합성된 229-nt ssDNA 단편을 이용하여 실제로 RNA polymerase에 의한 priming ability와 protein interaction을 확인하였다. in vitro primer RNA 합성 실험 결과, 229-nt ssDNA 단편은 filamentous M13 phage의 주형 DNA에서와 비슷한 효율로 시발체 RNA를 합성하였으며, 이 반응은 strand-specific하게 이루어졌다. DNase I footprinting과 gel retardation 실험 결과, RNA polymerase와 SSB 단백질은 229-nt ssDNA 단편에 stable interaction을 하며, 시발체 RNA를 합성하였다. 또한, in vivo 조건 하에서 RNA polymerase의 저해제인 rifampicin을 처리하여 세포내에 ssDNA 중간체가 집적되는 정도를 비교하여 본 결과, 플라스미드 pGKV21은 rifampicin-sensitive RNA polymerase가 상보가닥 합성에 관여 함을 보여 주었다.

• BMB Reports
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• 제43권4호
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• pp.284-290
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• 2010

Replication of positive-strand RNA virus is mediated by a virus-encoded RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). To study the replication of Ectropis obliqua virus (EoV), a newly identified insect virus belonging to the family Iflaviradae, we expressed the RNA polymerase domain in Escherichia coli and purified it on a Ni-chelating HisTrap affinity column. It is demonstrated that EoV RdRp initiated RNA synthesis in a primer and poly (A)-dependent manner in vitro. Furthermore, the effect of primer concentration, temperature, metal ions ($Mg^{2+}$, $Mn^{2+}$, and $K^+$) on enzymatic activity were determined. Our study represented a first step towards understanding the mechanism of EoV replication.

• BMB Reports
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• 제28권6호
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• pp.538-545
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• 1995

When DNA replication of simian virus 40 (SV40) is initiated on the replication origin, the regions containing the initiation sites of DNA primase, which participates in the transient RNA primer synthesis for formation of Okazaki fragments in the lagging strand, were chosen as the target sites of antisense RNA for studies of the inhibition of SV40 DNA replication. Four recombinant transcription vectors, pUC-PrI, pUC-PrII, pGEM-PrBS, and pGEM-PrSN, coding antisense RNA, were constructed. Four antisense RNAs (named as I, II, BS, and SN) having the size of 18, 19,58, and 123 nts, respectively, were made from the transcription vectors by in vitro transcription. And then, antisense RNA in the concentration of 2${\mu}m$ were added to COS cells transfected with pATSV-W which is a recombinant plasmid containing the SV40 origin of replication. The inhibitory extent of DNA replication was measured by DpnI resistance and was confirmed by measurement of transient RNA primer synthesis. The result shows that six combinations of antisense RNA (I, II, BS, SN, I+SN, and BS+SN) lead to the inhibition of SV40 DNA replication by up to 85%.

• 한국식물병리학회:학술대회논문집
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• 한국식물병리학회 2003년도 정기총회 및 추계학술발표회
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• pp.136.2-137
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• 2003

In order to diagnose and differentiate jujube witches' broom (JWB) phytoplasma rapidly, oligonucleotide primer pair, 16Sr(V) F/R, for polymerase chain reactions (PCRs) was designed on the basis of 165 rRNA sequences of JWB phytoplasma. The PCR employing phytoplasma universal primer pair P1/P7 consistently amplified DNA in all tested phytoplasma isolates. But no phytoplasma DNA was detected in healthy jujube seedlings. The nested PCR, the primer pair 16S(V) F/R, about 460 bp fragment, amplified DNA in all tested JWB and related phytoplasmas including LiWB phytoplasma of the 165 rRNA group V, but no DNA amplification was detected from other phytoplasma strains such as group 16SrI (Aster yellows) and group 16SrⅩII (Stolbur group) phytoplasmas in which mulberry dwarf phytoplasma and chrysanthemum witches broom phytoplasma are belonged to, respectively The same results were obtained from both Korean- and Chinese-isolates of JWB. Nested-PCR using phytoplasma universal primer pair P1/P7 and 16S rRNA group V specific primer pair 16S(V) F/R could detect group V phytoplasma rapidly and easily, in particular JWB phytoplasma.

• 한국식품과학회지
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• 제32권6호
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• pp.1331-1335
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• 2000

김치 젖산균인 WL6는 API kit 또는 Biolog system방법에 의하여 동정한 결과, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 또는 Lactobacillus bifermentans로 나타나 동정되지 않았다. 그러나, pepN gene과 16S rRNA gene으로부터 2개의 specific-sequence primer set을 제조하여 PCR 방법으로 증폭한 후에 표준균주들과 비교한 결과, WL6는 Lactobacillus bifermentans로 추정되었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제31권3호
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• pp.285-292
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• 1993

간흡충 total RNk에는 많은 량의 185 rRNA가 함유되어 있었지만 285 rRNA는 그 양이 매우 적었다. 약 $8{\;}{\mu\textrm{g}}의{\;}poly{\;}(A)^{+}$ mRNAS부터 합성된 double-stranded CDNA는 대부분이 0.4-4.2 kb 크기이었으며 9.5 kb에 달하는 것도 있었다. 이미 보고되어 있는 tropomyosin의 amino산 서열을 기준하여 5개의 degenerated oligonucleotide (sense primer 2개와 antisense primer 3개)를 합성하였다. TotalcDNA를 template로 하고 sense primer와 antisense primer를 조합하여 실시한 PCR 산물 중에서 580 bp 크기의 특이 유전자가 나타났다. 만손주혈흡충의 tropomyosin CDNA를 탐색자로 써서 Southern hybridization했을 때 이 유전자만이 검출되어서. 이 유전자는 간횹충 tropomyosin (CSTM) CDNA의 일부분일 가능성이 높다고 생각되어 sequencing vector인 POEM-3Zf(-)에 cloning한 다음 염기서열을 결정하였다. nRf 증폭된 CSTM CDNA는 크기가 575 bp이었으며 191개의 predicted amino산 서열은 한 개의 open reading frame을 갖고 있었다 CSTM CDNA의 amino산 서열은 만손주혈흡충 tropomyosln과 86.3%. Trichosoonvk: colhnfornis tropomyosin과 51.1% 의 유사성을 갖고 있었다. 이 CSTM cDNA fragment는 앞으로 간흡충 cDNA library를 screening하여 완전한 CnM CDNA를 cloning하기에 좋은 probe로 쓰일 것으로 예상된다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제21권1호
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• pp.55-58
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• 2005

In order to diagnose and differentiate jujube witches' broom (JWB) phytoplasma rapidly, oligonucleotide primer pair, 16Sr(V) F/R, for polymerase chain reactions (PCRs) was designed on the basis of 16S rRNA sequences of JWB phytoplasma. The PCR employing phytoplasma universal primer pair P1/P7 consistently amplified DNA in all tested phytoplasma isolates. But no phytoplasma DNA was detected from healthy jujube seedlings. The nested PCR, the primer pair 16S(V) F/R, about 460 bp fragment, amplified DNA in all tested JWB and related phytoplasmas including ligustrum witches' broom phytoplasma of the 16S rRNA group V, but no DNA amplification was detected from other phytoplasma strains such as groups 16SrI (Aster yellows) and 16SrXII (Stolbur group) in which mulberry dwarf phytoplasma and chrysanthemum witches' broom phytoplasma belong to, respectively. The same results were obtained from both Korean and Chinese isolates of JWB phytoplasma. Nested-PCR using phytoplasma universal primer pair P1/P7 and 16SrV group-specific primer pair 16S(V) F/R could detect group V phytoplasmas rapidly and easily, in particular JWB phytoplasma.