• 한국균학회지
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• 제22권2호
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• pp.130-137
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• 1994

담자균류인 잿빛 만가닥버섯 Lyophyllum decastes은 이미 항암작용이 있다고 보고된 바, 이 버섯의 유전연구와 균주개발을 위해 기초적 연구인 원형질체 분리와 재생에 관하여 실험하였다. 원형질체 분리의 최적 조건으로는 여러 효소의 혼용보다 Novozym 234(10 mg/ml)를 단용하였을 때 더 우수하였고, 삼투압 안정제로 0.6 M $MgSO_4$에서 효과적이었으며, $24^{\circ}C$ 에서 5일 배양한 균사와 효소액을 4시간 반응 시켰을 때 수득율이 높았다. 완충용액과 pH는 Na-phosphate buffer(pH 4)에서 원형질체 분리가 양호 하였으며, 고체배지보다 액체배지에서 자란 균사를 완충용액과 pH를 조절하지 않은 상태에서 효소와 반응시켰을 때 $12.5{\times}10^6\;cell/ml$로 높았다. 원형질체 재생시 균사가 배지 전면에 확산되어 성장하여 성장억제제로 Triton X-100(0.0025%)을 사용하였다. 원형질체 분리시와는 대조적으로 0.6M sucrose와 mannitol에서 재생이 효율적이었고, 각각 8.32%와 5.94%의 재생 빈도를 나타내었다.

• 한국산림과학회지
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• 제74권1호
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• pp.29-36
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• 1986

이태리포푸라 I-214 (Populus euramericana cv. I-214)의 기내배양(器內培養)한 엽육조직(葉肉組織)에서 원형질체(原形質體) 분리(分離)에 미치는 몇가지 요인(要因)에 대(對)해 조사(調査), 검토(檢討)하였다. 기내(器內)에서 배양(培養)된 아(芽)를 다량(多量)으로 증식(增植)하기 위한 배지(培地)는 MS 기본배지(基本培地)에 $0.1mg/{\ell}$의 BAP를 첨가(添加)한 것이 가상 좋은 성적을 나타냈다. 엽(葉) 1g 당(當) $2.4{\times}10^6$개의 가장 높은 원형질체(原形質體) 분리(分離) 빈도를 나타낸 것은 Cellulase R-10 2 %, Macerozyme R-10 0.8 %, Hemicellulase 1.2 %, Driselase 2.0 %, Pectolyase Y-23 0.05 %에 DTT와 MES 완충액을 첨가(添加)한 후 삼투압 안정제로 0.6 M의 Mannitol을 넣고 pH를 5.6으로 조정한 효소용액(酵素溶液)이었다. CPW 용액(溶液)으로 세정(洗淨)한 후 0.6 M의 Sucrose 용액(溶液)에 처리(處理)한 것이 회수율(回收率) 51.8 %로 가장 높게 나타났다.

• 한국균학회지
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• 제13권1호
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• pp.1-10
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• 1985

고등균류의 유전연구와 균주개발을 위한 원형질체 조작의 기초 연구로서 몇가지 주요 버섯류의 원형질체 분리에 관하여 실험한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. P. ostreatus와 V. volvacea의 원형질체 분리에 알맞는 효소는 ${\beta}-D-Glucanase+Novozym234+Snail enzyme$이었으며, 삼투압 조절제로는 0.6M $MgSO_{4}$였고, 이들을 Na-Maleate buffer로 pH 5.8에 조절하여 사용했을때 가장 많은 원형질체를 생성하였다. 2. P. ostreatus, P. florida, P. sajor-caju는 MCM에서 각각 4, 5, 3일간 배양한 균사체에서, L. edodes, F. velutipes는 PDA 배지에서 각각 2일과 5일간 배양했을때 가장 효과적이었으며, A. bisporus와 V. volvacea는 분리량이 극히 적었다. 3. V. volvacea의 균사체에 2-mercaptoethanol의 전처리는 효과가 없어 원형질체 분리는 적었으며, 액체배양 보다는 agar 배지상의 cellophan방법이 원형질체 분리에 있어서 효과가 좋았다. 4. 균사체에 효소처리후 1시간 부터 원형질체가 분리되면서 점차 증가하여 9시간경에 가장 많은 원형질체를 얻었으며, 시간이 갈수록 액포화현상으로 원형질체의 크기가 커졌다.

• 한국균학회지
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• 제15권1호
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• pp.14-18
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• 1987

This experiment was undertaken to investigate proper conditions for protoplast formation from Lyophyllum ulmarium. Combination of Novozym 234, ${\beta}-Glucuronidase$ and ${\beta}-D-Glucanase$ with 0.6 M Sucrose was the most effective for isolation of protoplasts. The optimal reaction time of mycelium with the lytic mixture was 3 hrs in shaking condition at 120 strokes $min-^1$. When the mycelium of L. ulmarium was cultured for 6 days on yeast glucose agar medium at $25^{\circ}C$, the formation of protoplasts was effective. The yeast glucose agar medium stabilized with 0.6 M sucrose was the most effective for reversion of protoplasts.

• 한국자원식물학회:학술대회논문집
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• 한국자원식물학회 2003년도 심포지엄
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• pp.50-58
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• 2003

Isolation and culture of leaf protoplasts from two chilli cultivars (Capsicum annuum var. accumnatum and Bird chilli) were developed to enhance selection process in the somatic hybridization programmes. In order to isolate the protoplasts from leaves of these two chilli cultivars different incubation periods (3, 5 and 10 hours) were tested with combinations of enzyme mixtures containing cellulase and macerozyme. Leaves were incubated on three enzyme mixtures (2% cellulase + 0.4% macerozyme, 1% cellulase + 0.2% macerozyme and 0.5% cellulase + 0.1 % macerozyme in 13% mannitol) at 251oC in the dark. Three hours of incubation using 2% cellulase and 0.4% macerozyme was the best for the protoplast isolation of both chilli cultivars tested. The yield was 5 ${\times}$ 108protoplasts/ml/ g leaf tissue in both chilli varieties. It was found that in the mixed nurse method using Nagata and Takebe (NT) medium supplemented with 1.0mg/12,4-D, NAA and BAP with 0.5M mannitol and 1.2% Sea Plaque agarose is the best medium for protoplast culture. Protoplasts of Capsicum annum var. accumnatum were alive for 14 days forming cell walls and initiating cell division.

• Applied Biological Chemistry
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• 제47권2호
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• pp.192-196
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• 2004

이온채널의 활성을 포함한 세포의 생리활성을 측정하기 위하여 토마토의 뿌리조직으로부터 원형질체를 분리하였다. 일반적으로 널리 사용되는 원형질체 분리법은 뿌리조직의 경우 효율이 좋지 않았다. 따라서, 다양한 조건을 변화시키며 분리효율을 조사하던 중 두 단계의 삼투압 처리로 원형질체 분리효율이 높아짐을 확인하였다. 첫 단계로 뿌리조직을 300 mM sorbitol을 포함하는 용액에서 30분간 배양한 후, 700 mM sorbitol과 세포벽 분해효소를 포함하는 용액으로 옮겼을 때, 원형질체 형성은 급격히 증가하였다. 이러한 분리방법의 최적 조건을 결정하기 위하여 pH와 삼투압, 배양시간, 세포벽 분해효소의 농도 등을 조사하였다. 원형질체 분리의 수율은 3% cellulase와 1% macerozyme, 0.1% pectolyase를 포함하는 pH 5.0의 혼합효소액에서 2시간 배양할 때 최대로 나타났다. ATPase 활성으로 평가한 원형질체의 세포활성은 뿌리조직의 시료에서 측정한 간과 유사하였다. 또한, 분리한 원형질체의 세포활성은 4시간 동안 감소하지 않아 생리활성 측정을 위한 시료로 적합하였다. 본 결과는 두 단계 삼투압 처리법이 토마토 뿌리조직으로부터 높은 수율의 원형질체 분리에 성공적임을 보인다.

• 한국연초학회지
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• 제1권2호
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• pp.138-149
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• 1979

본 시험은 담배 신품종 육종기술확립을 위하여 효율적으로 原形質體(protoplast)를 얻을수 있는 방법과 protoplast 배양조건을 조사하였다. 1. protoplast를 효율적이며 경제적으로 얻을 수 있는 세포붕괴, 細胞模解離 酵素의 농도는 0.5% macerozyme + 2% cellulase (또는 meicellase)였다. 2. 효소처리시간은 품종간에 약간의 차이는 있었으나 4시간 이상이 필요하였으며 1인 작업량으로 보아 4시간이 가장 적합하였다. 3. 等張液을 만들기 위하여는 0.5∼0.7M의 mannitol이나 sorbitol을 이용하는 것이 좋았다. 4. 세포융합시에 Ca++ 이온의 농도는 중요하며 9mM CaCl2를 포함한 PEG용액(0.5g/ml)을 쓰는 것이 가장 효과적이었다. 5. 분리된 protoplast는 B-5 培地에서 계속분열하여 colony를 형성하였다.

• Archives of Pharmacal Research
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• 제10권3호
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• pp.158-164
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• 1987

To obtain a new strain of Ganoderma lucidum by protoplast fusion technique, its protoplast formation and regeneration were studied. Several factors affecting the protoplast formation and regeneration were investigated to find their optimum conditions. The mycelium was grown for four days on the cellophane membrane placed on G. Incidum complete medium (GCM). When various commercial lytic enzymes were examined for protoplast isolation, the combination of Novozym 234 and $\beta$glucuronidase was found to be effective. An osmotic stabilizer, 0.6 M sucrose in 20 mM phosphate buffer pH 5.8, gave the highest yield of protoplasts. Three-hour incubation in shaking incubator was most suitable for releasing protoplasts. To increase the protoplast yield, pretreatment with 2-mercaptoethanol was carried out. The regeneration frequency in GCM containing 0.6M MgSO$_4$ 7$H_2O$ was shown to be 0.66%.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권1호
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• pp.23-28
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• 1994

Nicotiana tabaccum 'Xanti', Petunia hybrida 'Blue Star' 그리고 Chrysanthemum morifolium 'Baeckwang'을 공시하여 엽조직 유래의 mesophyII protoplast(MP)와 paraveinal mesophyII protoplast (PVMP) 간의 세포 활성을 조사하기 위하여 urea 투과성을 측정하였다. 아울러 엽육 조직에서 원형질체 나출을 위한 각종 효소제를 처리하고 경과 시간별로 관찰했으며, 나출 원형질체로부터 식물체 재생을 위한 NAA와 thidiazuron의 효과를 조사하였다. Vibratome을 이용한 엽육조직 절단방법은 엽조직의 상해를 최소화하고 조직절편도 최소 50 $\mu\textrm{m}$까지 절단할 수 있기 때문에 urea 투과성 검정과 원형질체 나출을 위한 필수적인 기술이다. 세포활성에 대한 urea투과성 측정은 공시한 3종 식물의 PVMP에서 모두 Ks=2.Ox$10^{-5}$cm/sec 정도가 MP보다 높았다. 효소혼합 용액(1.5% Cellulase R-10, l% Driselase, 0.5% Macerozyme R-10, 0.05% Pectolyase)을 4-8 시간 처리하는 것이 PVMP 나출에 유효하였다. 나출 원형체로부터의 캘러스 유기와 식물체 재생에는 2 mg/L NAA + 0.01 mg/L thidiazuron 처리구에서 가장 양호하였으며 조직별로는 PVMP에서 월등한 결과를 나타내었다. 따라서 엽조직을 대상으로한 원형질체 배양에 있어서 엽록소의 함량이 많은 MP보다는 재생력이나 세포 활성이 강한 paraveinal 엽육조직 유래의 세포를 집약적으로 나출시켜 실험재료로 이용한다면 더 높은 식물체 재생률을 얻을 수 있을 것으로 사료된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제28권1호
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• pp.13-18
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• 1985

세균의 protopalst 융합을 연구하기 위하여 Bacillus subtilis로부터 두 개의 영양 요구성 균주를 NTG처리에 의해서 분리하였다. 두 개의 영양 요구성 균주는 Uracil 요구성 균주와 Tryptophan 요구성 균주였다. $ura^-$균주와 $trp^-$균주의 친주로의 역돌연변이율은 각각 $2.4{\times}10^{-8}$과 $1{\times}10^{-8}$이하였다. Lysozyme 처리에 의하여 protoplast를 만들기 위한 최적 pH와 온도는 6.5와 $30^{\circ}C$였다. Protoplast 생성을 위한 lysozyme의 최적농도는 $200{\mu}g/ml$였다. Protoplast가 본래의 균체로 회복되는 율은 3.3%였다.