• Animal cells and systems
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• 제4권3호
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• pp.273-278
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• 2000

Transforming growth factor-$\beta$ (IGF-$\beta$)s are multifunctional small polypeptides synthesized in most cell types. TGF-$\beta$ exerts pivotal effects on both bone formation and resorption. In addition, increasing lines of evidence implicate TGF-$\beta$ as a potential coupling factor between these two processes during bone remodeling. In the present study, the expression form and the activation mechanism of latent-TGF-$\beta$ were investigated using specific antibodies for each isoform. TGF-$\beta$s were observed to be synthesized and accumulated in a large amount in cultured osteoblastic cells. The estimated molecular weights of intracellular TGF-$\beta$2 and -$\beta$3 were 49 and 55 kDa, respectively. Based on proteolytic digestion study and immunofluorescence observation, these precursor forms seemed to be accumulated in distinct intracellular compartments. To examine whether the internal pool of TGF-$\beta$ was possiblely regulated by external signals, their biological activites were examined in a conditioned media of this cell. Although the intact conditioned media did not contain detectable TGF-$\beta$ activity, heat-treatment or acid-activation of the conditioned media revealed significant TGF-$\beta$ activity. Furthermore, in the presence of estrogen, this activity was dramatically diminished. It is known that activation of latent TGF-$\beta$ can be achieved by different chemical and enzymatic treatments, or by incubation with certain cell types. This extracellular activation was suggested as a key step in the regulation of TGF-$\beta$ activity. In addition to these extracellular activation, this study suggests that the synthesis and intracellular processing are important regulation steps for TGF-$\beta$ action. In addition, this regulation Is specific for TGF-$\beta$ type 2, because the change was not observed in TGF-$\beta$3 in osteoblastic cell line.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제17권3호
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• pp.189-195
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• 2013

Amyloid-${\beta}$ peptide ($A{\beta}$), generated by proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP), plays a pivotal role in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). The key step in the generation of $A{\beta}$ is cleavage of APP by beta-site APP-cleaving enzyme 1 (BACE1). Levels of BACE1 are increased in vulnerable regions of the AD brain, but the underlying mechanism is unknown. In the present study, we reported the effects of ferrous ions at subtoxic concentrations on the mRNA levels of BACE1 and a-disintegrin-and-metalloproteinase 10 (ADAM10) in PC12 cells and the cell responses to ferrous ions. The cell survival in PC12 cells significantly decreased with 0 to 0.3 mM $FeCl_2$, with 0.6 mM $FeCl_2$ treatment resulting in significant reductions by about 75%. 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining showed that the nuclei appeared fragmented in 0.2 and 0.3 mM $FeCl_2$. APP-${\alpha}$-carboxyl terminal fragment (APP-${\alpha}$-CTF) associations with ADAM10 and APP-${\beta}$-CTF with BACE1 were increased. Levels of ADAM10 and BACE1 mRNA increased in response to the concentrations of 0.25 mM, respectively. In addition, p-ERK and p-Bad (S112, S155) expressions were increased, suggesting that APP-CTF formation is related to ADAM10/ BACE1 expression. Levels of Bcl-2 protein were increased, but significant changes were not observed in the expression of Bax. These data suggest that ion-induced enhanced expression of AMDA10/BACE1 could be one of the causes for APP-${\alpha}/{\beta}$-CTF activation.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제21권4호
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• pp.457-466
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• 2017

Survival of embryos largely depends on yolk processing during early development. Proteolytic enzymes, cathepsin B & D (ctsb & ctsd) are known to have some important roles in yolk processing of various fish species. Mature female red spotted groupers were injected with human chorionic gonadotropin (HCG) to induce ovulation. The fertilized eggs and embryos were sampled at 0, 4 and 24 HPF (hours post fertilization). Survivals of each groups of embryos were checked at 24 and 48 HPH (hours post hatching). Transcripts of ctsb & ctsd showed the highest level at 0 HPF and relatively high at 4 HPF, but greatly decreased at 24 HPF. In bad egg quality group (BE, embryos survived until 24 HPH), transcript level of ctsb at 4 HPF were significantly lower than the transcript level at the same stage in good egg quality group (GE, embryos survived until 48 HPH) while no significant change of ctsb transcript level was observed at 0 or 24 HPF between BE and GE. Transcript level of ctsd was decreased at 24 HPF, but the difference was not as strong as the case of ctsb transcript. These results suggest that maternal ctsb transcript rather than ctsd transcript is likely to be involved in egg quality resulting in the difference of survival rate of embryos at early developmental period in this species.

• Journal of Microbiology
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• 제38권4호
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• pp.218-223
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• 2000

Using two drugs, tunicamycin and brefeldin A, which affect protein processing, we investigated the intracellular processing mechanism of secreted aspartyl proteinase 1 (SAPl) of Candide albicans. Three intracellular forms of SAPI were detected by immunoblotting using menoclonal antibody (MAb) CAPl. Their molecular weights were approximately 40, 41 and 45 kDa, respectively. The 41 kDa protein is a glycoprotein and may be the same as the extracellular form judging by its molecular mass. The 40 kDa protein was the unglycosylated form and its molecular mass coincided with deglycosylated SAPl and the 45 kDa protein was also the unglycosylated form. Neither the 40 and 45 kDa proteins were detected in the culture supernatant of C. albicans. These suggested that the 40 and 45 kDa proteins might be intracellular precursor forms of SAPI. These results show that SAPI is translated as a 45 kDa precusor form in the endoplasmic reticulum and the 45 kDa precursor farm undergoes proteolytic cleavage after translocation into the Golgi apparatus, generating the 40 kDa precursor form. This 40 kDa precursor is converted into a 41 kDa mature form through glycosylation in the Golgi apparatus. The mature form of the 41 kDa protein is sorted into secretary vesicles and finally released into the extracellular space through membrane fusion. When the glycan region of SAPl was digested with N-glycosidase F, both stability and activity of the enzyme decreased. These results indicate that the glycan attached to the enzyme may, at least in parti be related to enzyme stability and activity.

• 한국수산과학회지
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• 제23권1호
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• pp.40-50
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• 1990

크릴가공시 부산물로 얻어지는 잔사를 보다 효율적으로 이용하기 위하여 크릴가공 잔사로부터 carotenoprotein을 추출하여 이를 식품착색료로 이용할 목적으로 호소를 이용한 carotenoprotein의 추출조건 및 품질안정성에 대하여 검토하였다. 크릴가공 잔사중 총 astaxanthin함량은 자숙크릴 잔사 및 생동결 크릴 잔사에서 각각 $35.1mg\%,\;22.1mg\%$ 였으며, $98.6mg\%,\;61.9mg\%$였다. Chitin함량은 크릴가공 잔사인 자숙크릴과 생동결크릴에서 각각 $6.9\%,\;4.5\%$였으나 carotenoprotein에서는 검출되지 않았다. Trypsin이 carotenoprotein추출에 가장 효과적이었으며, papain, pepsin, protease는 거의 효과가 나타나지 않았다. Trypsin 첨가농도 $0.5\%$, 반응온도 $4^{\circ}C$에서 24시간 분해하였을 때 단백질 및 carotenoid의 회수율은 자숙시료가 각각 $83\%,\;74\%$로 가장 좋았다. 생동결크릴의 경우는 자숙크릴에 비해 단백질 및 carotenoid 회수율이 다소 떨어졌다. Carotenoprotein의 아미노산조성중 glutamic acid 와 aspartic acid의 함량이 가장 많았으며 필수 아미노산함량도 전체 아미노산의 $38.3\%\~43.6\%$를 차지하였다. Carotenoprotein중의 carotenoid는 TLC분석에 의해 astaxanthin, astaxanthin monoester, astaxanthin diester로 분리되었으며, 이들의 상대량은 각각 $25\~30\%\;,35\~40\%\;40\~45\%$였다. Carotenoprotein의 안정성은 저온($-20^{\circ}C\;4^{\circ}C$)일수록 안정하였으며, BHT와 protease inhibitor인 trasylol을 동시에 가한 것이 BHT와 trasylol만을 단독으로 가한 것보다 안정성이 좋았다.

• 생명과학회지
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• 제8권6호
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• pp.627-637
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• 1998

수산가공공장에서 원료어 처리시 생성되는 부산물인 참치 내장중 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 분해효소를 추출하고, 이것을 부분 정제하여 참치 유문수 유래 조효소(TPCCE)를 대량으로 제조하였다. 제조된 TP-CCE에 대한 최적활성조건을 규명하였으며, 아울러 시판 정제 단백질 분해효소들과 비교하였다. 또한 TPCCE의 열안정성을 높이고자 몇가지 종류의 담체에 물리적으로 흡착시켜 제조한 고정화 효소의 열안정성을 검토하였다. 1. 참치 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 가수분해효소를 부분정제하여 조효소 상태를 추출하였으며 이때의 수율은 약 2.7% 정도로 매우 높았다. 활성은 천연기질인 카제인에 대하여 0.54 U/mg이었고, 합성기질인 BTEE와 BAEE에서는 각각 1.10과 2.69 U/mg로서 시판정제효소인 trypsin과 유사한 활성을 나타내었다. 2. 참치유문수 유래 조효소의 천연기질인 casein에 대한 가수분해의 최적조건은 pH 10.0, 반응온도 45$^{\circ}C$, 반응시간 12시간이었으며, 이 때의 가수분해도는 약 80%였다. 3. 참치 유문수로부터 추출된 조효소를 여러 가지 담체에 고정화시켰으며 이용된 담체중에서 고정화율은 Chitopearl, DEAE-Cellulose 및 키틴 순으로 가장 높았으며(70~80%), 합성기질인 BAEE에 대한 활성은 키틴, DEAE-Cellu-lose 및 키토산 고정화 효소의 순서로 각각 2.46 U/mg, 2.35U/mg, 및 2.29 U/mg이었고, BTEE에 대한 활성은 키토산, 키틴, CM-Cellulose의 순서로 각각 0.89 U/mg, 0.88 U/mg 및 0.86 U/mg이였다. 이중 키틴 고정화 효소가 모든 조건에서 충분한 효과를 보여 가장 효율적으로 나타났다. 4. 고정화 효소의 열안정성에서 대부분의 고정화 효소는 유리 TPCCE보다 높은 열안정을 보였으며, 특히 DEAE-Ce-llulose를 이용한 고정화 효소는 6$0^{\circ}C$의 높은 온도에서 7일이 경과한 후에도 약 95%의 활성을 유지하여 장시간의 효소 반응공정이나 고정화 효소를 이용한 컬럼 반응에서의 연속적 단백질 가수분해물 생성과 같은 공정에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

• 한국식품과학회지
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• 제34권4호
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• pp.570-576
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• 2002

골뱅이의 가공 부산물인 내장의 효율적인 이용을 위해 골뱅이 내장을 마쇄한 후, 염을 25% 첨가하고 단백질 가수분해효소로서 상업용으로 많이 이용되는 Flavourzyme, Neutrase, Protease NP Prozyme을 각각 0.05, 0.1% 첨가하여 $10^{\circ}C$에서 6개월 동안 숙성하여 특성을 관찰하였다. 상업용 효소를 첨가한 모든 골뱅이 내장젓갈에서 숙성 30일까지 급격하게 감소하며, 숙성기간이 증가할수록 약간의 pH가 증가하였으며 숙성 150일에서 pH가 약간 감소하여 숙성기간 180일에서는 pH $6.1{\sim}6.4$까지 다시 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, Flavourzyme 첨가구가 다른 효소 첨가구에 비해 pH 변화의 증감이 큰 편이며, Prozyme 첨가구는 이와는 달리, 점차적으로 pH의 감소경향을 나타내었다. 아미노 질소 변화는 효소 첨가량에 비례하여 증가하였으며, 최대 아미노 질소는 Flavourzyme 0.1% 첨가구가 646 mg%를 나타내었다. 총질소 함량은 숙성기간 120일까지는 계속적인 증가를 보였으며, 숙성 120일부터 180일까지 다시 급격하게 감소하는 경향을 보였으며, 효소에 따른 총질소 함량의 증감이 상이하게 관찰되었다. SDS-PAGE에 의한 골뱅이 내장젓갈의 분해결과는 모든 효소 첨가구에서 높은 염함량에도 불구하고 숙성기간의 증가에 따라 점차적으로 분해되는 것을 보였지만, 효소 첨가량에 따라서는 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 골뱅이 내장젓갈을 6개월간 숙성한 후, 시판되고 있는 2종류의 액젓과 색도를 비교하여 골뱅이 내장 젓갈이 L값이 2배 이상 높았고, a값과 b값은 거의 유사하게 측정되었다.

• 생명과학회지
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• 제16권7호
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• pp.1133-1140
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• 2006

E. coli HtrA (High temperature requirement protein A)의 human homologue 중 하나인 HtrA1은 IGFBP를 절단하여 IGF의 활동을 조절하는 serine protease으로 알려졌다. HtrA1의 serine protease 활성이 여러 질병의 발병 mechanism과 연관성을 가진 것으로 예상되고 있지만, 이런 상관관계를 밝히기 위해서 기본적으로 필요한 다량의 HtrA1 단백질의 발현 및 정제조건과 HtrA1 serine protease의 최적 활성조건이 확립되어 있지 않은 상황이다. 따라서 본 연구에서는 pGEX 시스템을 이용하여 E. coli에서 mature HtrA1인 ${\Delta}149(WT)$와 catalytic site mutant인 ${\Delta}149(S328A)$를 85%의 순도로 1 liter 배양 시, 정제된 단백질을 각각 $400{\mu}g,\;520{\mu}g$ 얻을 수 있는 발현조건을 정립하였다. 또한 HtrA1 serine protease 활성은 protease의 농도와 substrate와의 반응시간에 dependent하며, substrate와의 반응온도가 $42^{\circ}C$일 때 최적의 serine protease활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 $200{\mu}M$의 HtrA1 serine protease를 $37^{\circ}C$에서 3시간 반응 시켰을 때, substrate로 사용한 ${\beta}-casein$의 약 50%가 절단되는 것을 관찰하였다. 따라서 이 반응조건에 사용한 HtrA1의 양을 1 unit으로 하여 HtrA1의 serine protease활성을 여러 조건에서 비교 분석할 수 있다 본 연구에서 정립한 mature HtrA1을 다량으로 얻을 수 있는 발헌 및 정제조건과 serine protease 최적 활성조건은 HtrA1의 serine protease 활성과 생물학적 기능의 상관관계를 이해하는데 활용될 수 있을 것이다.

• 한국식품과학회지
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• 제29권1호
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• pp.77-81
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• 1997

다시마와 효소 처리한 고등어육으로 조미료 소재를 제조하기 위해 가공조건을 검토한 결과는 다음과 같다. 적절한 자숙고등어육을 얻기위해 papain, bromelain, potease-A의 처리 결과 효소의 첨가농도는 0.03%, 효소처리시간은 90분정도가 적당하였다. 건조에 따른 효소처리 고등어육의 영향은 온도가 높을수록 건조 속도가 빨랐으며, 적절한 건조 조건은 $100^{\circ}C$에서 4시간 처리였다. 자숙고등어육을 효소처리 하였을 때의 protease-A 처리구의 총유리아미노산 함량이 5,007.3 mg/100 g으로 가장 높았고, glutamic acid, glycine, alanine, arginine 등의 정미성 아미노산이 약 33.0%를 차지하였다. Bromelain처리구와 papain처리구는 histidine, glutamic acid, aspartic acid, leucine, arginine 등이 주요아미노산이였다. 다시마의 총유리아미노산의 함량은 5281.8 mg/100 g으로, 주요 유리아미노산으로 glutamic acid, aspartic acid이었다. 시제품의 관능검사 및 탁도실험에서 제품 C가 멸치나 제품 A와 B보다 종합평가에서 우수하였으나, flavor에서 약간의 이취가 느껴져 이에 대한 보완이 필요하다고 생각되었다.

• 한국수산과학회지
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• 제23권2호
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• pp.125-136
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• 1990

To develope a rapid processing method for fish sauce, processing conditions of fish sauce from sardine waste was investigated. The chopped waste was homogenized and hydrolyzed by commercial proteolytic enzymes such as Complex enzyme-2000($2.18\cdot10^4$ U/g solid) and Alcalase($1.94\cdot10^4$ U/g solid) in a cylindrical vessel with 4 baffles and 6-bladed turbine impeller. Optimal temperature for the case of hydrolysis with Complex enzyme-2000 was 50 and that with Alcalase was $55^{\circ}C$. In both cases, the reasonable pH, amount of water for homo-genization, enzyme concentration and hydrolyzing time were 8.0, $40\%$ (W/W), $3\%$ and 100 min, respectively. Heating of the filtrated hydrolysate for 2 hours at $90^{\circ}C$ with $6\%$ of invert sugar was suitable for pasteurization of the hydrolysate and inactivation of enzymes. Flavor, taste and color of the hydrolysate was improved during the thermal treatment in which the browning reaction products might participate and result in antioxidative and bactericidal effects. Combined use of $0.005\%$ of Caryophylli flos with invert sugar was also effective for the improvement of taste. Yield of the fish sauce based on the total nitrogen in the raw sardine waste was $91.2\~92.3\%$ and $87.2\~87.8\%$ of the total nitrogen in the fish sauce was in the form of amino nitrogen. The pH, salinity and histamine content of the fish sauce prepared with $15\%$ of table salt were $6.1\~6.2$, $14.2\~14.4\%$ and less than $10mg\%$, respectively. The fish sauce was stable during the storage of 60 days at $26\pm3^{\circ}C$ on bacterial growth and its quality was also maintained.