• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제27권4호
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• pp.417-426
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• 2023

The TRPM4 gene encodes a Ca²⁺-activated monovalent cation channel called transient receptor potential melastatin 4 (TRPM4) that is expressed in various tissues. Dysregulation or abnormal expression of TRPM4 has been linked to a range of diseases. We introduced the hemagglutinin (HA) tag into the extracellular S6 loop of TRPM4, resulting in an HA-tagged version called TRPM4-HA. This TRPM4-HA was developed to investigate the purification, localization, and function of TRPM4 in different physiological and pathological conditions. TRPM4-HA was successfully expressed in the intact cell membrane and exhibited similar electrophysiological properties, such as the current-voltage relationship, rapid desensitization, and current size, compared to the wild-type TRPM4. The presence of the TRPM4 inhibitor 9-phenanthrol did not affect these properties. Furthermore, a wound-healing assay showed that TRPM4-HA induced cell proliferation and migration, similar to the native TRPM4. Co-expression of protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 6 (PTPN6 or SHP1) with TRPM4-HA led to the translocation of TRPM4-HA to the cytosol. To investigate the interaction between PTPN6 and tyrosine residues of TRPM4 in enhancing channel activity, we generated four mutants in which tyrosine (Y) residues were substituted with phenylalanine (F) at the N-terminus of TRPM4. The YF mutants displayed properties and functions similar to TRPM4-HA, except for the Y256F mutant, which showed resistance to 9-phenanthrol, suggesting that Y256 may be involved in the binding site for 9-phenanthrol. Overall, the creation of HA-tagged TRPM4 provides researchers with a valuable tool to study the role of TRPM4 in different conditions and its potential interactions with other proteins, such as PTPN6.

• 미생물학회지
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• 제44권3호
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• pp.178-185
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• 2008

조류 독감바이러스(avian influenza virus, AIV)는 사람에게서 발생하는 인플루엔자 대유행에 중요한 역할을 한다. 특히 최근 AIV H9N2형에 의한 가금류 감염이 빈번히 나타나고 있어 인체 감염이 상당히 우려되는 실정이다. 본 연구에서는 최종적으로 AIV의 HA와 NA 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청을 생산하고자 하였다. 먼저 감염된 닭에서 분리된 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96의 게놈RNA로부터 RT-PCR 방법으로 HA와 NA 단백질 N-말단부위에 해당하는 염기서열을 증폭하였다. 이렇게 증폭된 DNA단편은 E. coli 발현벡터 pGEX4T-1에 삽입한 후, BL21 세포에서 각각의 GST fusion protein (GST-HAln와 GST-NAn) 형태로 발현하였다. GST-HAln와 GST-NAn은 모두 glutathione sepharose column을 사용하여 분리 및 정제하였으며, 정제된 단배질을 항원으로 사용하여 토끼 항혈청을 생산하였다. 생산된 항혈청의 항원특이성은 AIV H9N2 한국분리주 A/Ck/Kr/MS96/96로 감염된 MDCK 세포의 cell extract를 사용하여 immunoblotting을 수행함으로써 확인하였다. 본 실험결과AIV H9N2의 HA와 NA단백질 N-말단부위에 해당하는 재조합GST fusion protein과, 이들 각각의 단백질에 특이적으로 반응하는 항혈청은 앞으로AIV 감염의 진단 뿐만 아니라, AIV에 대한 기초연구에 중요한 재료로 사용될 것으로 기대한다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제10권2호
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• pp.1-11
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• 1983

황소의 정액에서 베타 굴룩유로니다아제를 부분적으로 정제하였다. 이 정제과정에는 $(NH_4)_2SO_4$ 의 분획분리법, 두개의 연속적인 DEAE-셀루로오즈 콜럼 및 등전초점화법(pH4-6) 및 세파덱스 G-200의 절여과 방법이 쓰여졌다. 등전초점화(lsoelectric focusing)법을 사용했을때 pH5.13에서 베타 굴룩유로니다아제는 한 형태의 단백질로 존재하였다. 고도로 정제된 베타 굴룩유로니다아제는 전기영동법에 의해 한개의 주된 띠와 약간의 불순물의 띠로 나타났고 특수활동도는 34Units/mg 단백질로 나타났다. 이 효소는 pH 5.2 와 $48^{\circ}C$ 에서 가장 높은 활동도를 나타냈다. 알부민이나 0.15M 소금용액에서 베타 굴룩유로니다아제는 활동도가 상승됐다. 페놀프타레인-모노-베타-굴룩 유로닉산을 기질로 사용했을때 km값은 2.9mM 이었고 Vmax값은 $0.8{\mu}$mole/min 이었다. 대두의 콘카나발린 A에 흡착하는 것으로 보아 이 효소는 당단백질임이 확인됐다. 토끼, 사람의 정자 아크롬좀 추출물 및 정액에서 이 효소는 높은 활성도를 나타냈다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제39권11호
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• pp.1647-1653
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• 2010

군소에서 추출한 다당류로부터 DEAE-Sepharose 상에서 glycosaminoglycan(GAG)을 정제하여 기능기의 분포, 구성당의 분포, 이당류의 조성과 당 구조를 조사하였다. 정제한 GAG는 기본 형태를 구성하는 이당류 단위가 전체 구성물 중 55% 이상을 차지하고 있는 다당 복합체였다. 정제한 GAG는 1648 $cm^{-1}$에서 amide I의 특징적인 띠와 1457 $cm^{-1}$에서 C-O stretch, 탄수화물 및 아미노산의 특징, 866 $cm^{-1}$에서 단당류의 특징을 보이는 것으로 나타났다. 정제한 GAG는 fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, glucose, galactose, 미량의 mannose와 xylose로 구성되어 있는 것으로 나타났고, 이중에서 N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine이 70% 이상을 차지하는 다당 복합체인 heparan sulfate인 것으로 추정되었다. 군소 GAG는 단백질핵의 threonine 잔기에 O-연결된 GlyUA(2S)-GlcNS와 GlyUA-GlcNS(6S) 구조를 가지고 있는 것으로 나타났다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권4호
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• pp.556-561
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• 1997

해수로부터 분리한 V. cholerae non-O1 FM-3 이 생산하는 hemolysin의 특성에 관하여 연구한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. V. cholerae non-O1 FM-3이 생산하는 hemolysin은 대수증식기일 때 가장 높은 활성을 나타내었으며, Sephadex G-100 gel column chromatography로 부분정제한 후 hemolysin의 특성을 실험한 결과, pH 7.0, $4^{\circ}C$에서 가장 안정하였으며, $60^{\circ}C$, 30분 가열에 의해 완전히 실활되었다. 2. 적혈구와 hemolysin이 반응할 때, $Na^+,\;K^+$과 같은 1가 양이온을 첨가하면 약간의 활성증가를 보였으며, $Ca^{2+},\;Mg^{2+},\;Mn^{2+}$과 같은 2가 양이온을 첨가하였을 때 급격한 활성증가를 보였고, 반면 $Zn^{2+}$ 첨가시에는 급격히 활성이 저하되었다. 3. 적혈구 현탁액과 hemolysin을 각각 다른 온도대에서 반응시킨 결과, $4^{\circ}C$에서도 온도와 관계없이 적혈구막과 hemolysin의 결합이 가능한 온도 비의존적인 제1단계와, 용혈황성의 최적온도대인 $37^{\circ}C$에서만 용혈작용이 일어나는 온도 의존적인 제2단계로 나누어졌다.

• Journal of Nutrition and Health
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• 제19권6호
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• pp.363-373
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• 1986

This study was devised to elucidate whether soused shrimp exhibits a digestive action on boiled pork meats. and the mechanism by which sousing with a high concentration of sodium chloride preserves nutrients in foods for a prolonged pe\ulcornerriod. Protease was isolated from soused shrimp using a combination of ammonium sulfate fractionation. DEAE - cellulose ion exchange chromatography and gel filtra\ulcornertion. The isolated protease had specific activity of 1.560 units. 210 purification fo\ulcornerld with an yield of 38%. Its optimum pH and temperature were 8.0 and $43^{\circ}C$ respectively. The molecular weight of the enzyme was 35.000. The Km value of the enzyme for casein was 1.6 x $10^{-6}$ M The e=yme required the presence of cu\ulcornerpric ion to exhibit its full activity. Eighty eight percent of the enzyme activity was in\ulcornerhibited by 3.5M NaCI showing a reversibly linear decrease of the enzyme activity as NaCI concentration increased. The nature of the inhibition by NaCl was rever\ulcornersible and noncompetitive. The protease activity in soused shrimp was well preser\ulcornerved with the elapse of time at least in part due to NaCI induced suppression of autodigestion. The enzyme was denatured by acid easily. i.e. 1% of the original activity remained after staying at pH 2 for 10 minutes. which is within the norm\ulcorneral range of pH of the human stomach. Soused shrimp was observed to be one of those containing the highest protease activity compared with the other soused foo\ulcornerds such as soused oyster. squid. clam. and Pollack intestine with respect to spec\ulcornerific activities of dialized 1:4 whole homogenates(w/v) in 5 mM sodium phospha\ulcornerte - 2.4 mM j3 - mercaptoethanol buffer. pH 8.0. Casein and boiled meats including pork, beef, and chicken appeared to be the good substrates for the protease. Casein was the best. Therefore. the ingestion of boiled meats including pork together with soused sh\ulcornerrimp would help digestion of boiled pork in human not only by increasing appe\ulcornertite also by the direct proteolytic digestion of boiled meats by soused shrimp to\ulcorner some extent. And a high concentration of sodium chloride inhibited the protease activity reversibly in a remarkable degree, which ensued in a significant retardat\ulcornerion of autodigestion of protein in foods by proteases, and hereby contributed to the preservation of foods for an extended period.

• Applied Biological Chemistry
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• 제46권2호
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• pp.79-83
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• 2003

난균류에 속하는 Phytophthora spp.와 pythium spp.에서 분비되는 단백질인 elicitin은 식물과 병원균과의 비친화적 관계에서 과민감반응을 유도하는 인자로 알려져 왔다. 국내에서 수집된 5종의 Phytophthora spp로부터 분리된 elicitin들은 무, 배추, 고추에서 과민감 반응을 유도 하였으나 오이, 토마토에서는 볼 수 없었다. 특히 지금까지 보고가 되지않은 P. cambivora KACC 40160균주의 배양액으로부터 ion exchange와 gel filtration을 이용하여 고추에 과민감반응을 유도하며 분자량이 10kDa인 새로운 elicitin을 순수분리 하여 cambivorein이라 명명 하였다. 분리된 cambivorein의 N-말단 아미노산 서열분석 결과 ${\beta}-isoform$의 특징인 13번째 아미노산이 Iysine을 가지고 있었으며 기존의 다른 종류의 elicitin과는 다른 아미노산으로 구성되어 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권2호
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• pp.163-167
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• 2012

D-Xylose는 Saccharomyces cerevisiae에서 기질로 이용될 수 없어 S. cerevisiae가 이용 가능한 D-xylulose로의 전환이 요구된다. 효소고정화 시스템을 통한 D-xylose로부터 D-xylulose로의 전환을 위해 대장균의 D-xylose 이성화효소(XI)의 카르복시 말단에 양이온 교환수지를 이용한 단순 정제 및 고정화가 가능하도록 10-arginine tag(R10)을 융합하였다. 융합단백질인 XIR10은 재조합 대장균에서 과잉발현되었고 단일 단계의 양이온 교환 크로마토그라피를 통하여 고순도로 정제되었다. 정제된 XIR10은 카르복시 말단의 10-arginine tag과의 정전기적 상호작용을 통하여 양이온 교환수지에 고정화되었다. 고정화 및 비고정화된 XIR10은 넓은 범위의 pH 및 온도에서 비슷한 D-xylose 이성화효소 활성을 보였다. 이 결과는 양이온 교환수지로의 고정화는 XIR10의 효소적 기능에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 고정화된 XIR10의 최적화된 조건에서 D-xylose의 25%는 D-xylulose로 이성화되었다. 본 연구의 결과들은 10-arginine tag과 양이온 교환수지간의 상호작용을 통해 정전기적 고정화된 XIR10이 D-xylose로부터 D-xylulose로의 전환에 응용 가능하다는 것을 명확하게 보여주었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제20권2호
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• pp.228-235
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• 1977

산업폐수가운데 유기성폐수로서 설탕, Ice cream 및 맥주공장폐수등 3종을 택하여 그중에 번식하는 유용한 미생물로서 생장도활성이 큰 효모균주를 분리하고 선정균주에 의한 폐수처리실험한 결과 최적조건하($pH\;4.5{\sim}5.5,\;30{\pm}1^{\circ}C,\;O_2\;0.2\;v/v/min.,\;600{\sim}900\;r.p.m.$) 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 분리동정한 Candida curvata는 3종의 식품공장폐수에 배양실험한 결과, 무기영양원 첨가시 생육이 양호하여 폐수처리에 이용가능한 균주이었다 2) 폐수의 멸균조작의 유무는 설탕및 맥주공장폐수의 경우, 배양결과에 큰 차이가 없었으며, 다만 Ice cream공장폐수의 경우 비멸균시 induction period가 훨신 장시간이었다. 3) 비멸균배양시 최대 비증식속도는 설탕, Ice cream 및 맥주공장폐수 순으로 각각 0.5, 0.5 및 1.0/hr이었다. 4) 접종량을 늘리면, 비멸균시에서도 induction period가 짧아지고 따라서 배양시간이 단축되었다. 5) 건조균체량은 설탕, 맥주 및 Ice cream공장폐수 순으로 폐수 $1{\ell}$당 각각 175mg, 628mg 및 857mg이었고, 균체의 조란백함량은 같은 순으로 각각 52%, 54% 및 54%이었다. 6) BOD 제거율은 위의 5)항과 같은 순으로 각각 49%, 80%, 및 64%이었다.

• Journal of Yeungnam Medical Science
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• 제3권1호
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• pp.41-48
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• 1986

사람의 적혈구막으로부터 Band 3를 분리정제하고 이를 liposome 내로 도입시켜 그 결과를 관찰하였다. 적혈구를 약알칼리 저장액으로 용혈시켜 막을 분리한 후, 저이온강도 용액으로 처리하여 Band 4를 추출하였다. Triton X-100 추출액에 p-chloromercuribenzoate를 가하고 sucrose density gradient ultracentrifugation후 fractionation하여 Band 3를 정제하였다. phosphatidyl L-serine과 cholesterol을 1 : 1 molar ratio로 섞고 진공회전 증발기를 사용하여 chloroform을 제거한 후 Triton X-100을 제거한 Band 3용액을 가하고 sonication함으로 liposome(reverse-phase evaporation vesicle)을 만들면서 Band 3를 도입 시켰다 Band 3의 분리정제 및 liposome에 도입되었음은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영 동 후 coomassie brilliant blue 염색으로 확인할 수 있었다.