• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권1호
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• pp.1-8
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• 2011

Techniques to evaluate gene expression profiling, such as sufficiently sensitive cDNA microarrays or real-time quantitative PCR, are efficient methods for monitoring human pluripotent stem cell (hESC/iPSC) cultures. However, most of these high-throughput tests have a limited use due to high cost, extended turn-around time, and the involvement of highly specialized technical expertise. Hence, there is an urgency of rapid, cost-effective, robust, yet sensitive method development for routine screening of hESCs/hiPSCs. A critical requirement in hESC/hiPSC cultures is to maintain a uniform undifferentiated state and to determine their differentiation capacity by showing the expression of gene markers representing all three germ layers, including ectoderm, mesoderm, and endoderm. To quantify the modulation of gene expression in hESCs/hiPSC during their propagation, expansion, and differentiation via embryoid body (EB) formation, we developed a simple, rapid, inexpensive, and definitive multimarker, semiquantitative multiplex RT-PCR platform technology. Among the 9 gene primers tested, 5 were pluripotent markers comprising set 1, and 3 lineage-specific markers were combined as set 2, respectively. We found that these 2 sets were not only effective in determining the relative differentiation in hESCs/hiPSCs, but were easily reproducible. In this study, we used the hES/hiPS cell lines to standardize the technique. This multiplex RT-PCR assay is flexible and, by selecting appropriate reporter genes, can be designed for characterization of different hESC/hiPSC lines during routine maintenance and directed differentiation.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권1호
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• pp.169-178
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• 2010

The microbial community structure in Thailand soils contaminated with low and high levels of arsenic was determined by denaturing gradient gel electrophoresis. Band pattern analysis indicated that the bacterial community was not significantly different in the two soils. Phylogenetic analysis obtained by excising and sequencing six bands indicated that the soils were dominated by Arthrobacter koreensis and $\beta$-Proteobacteria. Two hundred and sixty-two bacterial isolates were obtained from arsenic-contaminated soils. The majority of the As-resistant isolates were Gramnegative bacteria. MIC studies indicated that all of the tested bacteria had greater resistance to arsenate than arsenite. Some strains were capable of growing in medium containing up to 1,500 mg/l arsenite and arsenate. Correlations analysis of resistance patterns of arsenite resistance indicated that the isolated bacteria could be categorized into 13 groups, with a maximum similarity value of 100%. All strains were also evaluated for resistance to eight antibiotics. The antibiotic resistance patterns divided the strains into 100 unique groups, indicating that the strains were very diverse. Isolates from each antibiotic resistance group were characterized in more detail by using the repetitive extragenic palindromic-PCR (rep-PCR) DNA fingerprinting technique with ERIC primers. The PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis. The genetic relatedness of 100 bacterial fingerprints, determined by using the Pearson product-moment similarity coefficient, showed that the isolates could be divided into four clusters, with similarity values ranging from 5-99%. Although many isolates were genetically diverse, others were clonal in nature. Additionally, the arsenic-resistant isolates were examined for the presence of arsenic resistance (ars) genes by using PCR, and 30% of the isolates were found to carry an arsenate reductase encoded by the arsC gene.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권6호
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• pp.335-339
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• 2001

우리나라 포도원에서 가장 많이 발생하여 피해를 주고 있는 grapevine leafroll-associated 3 Closterovirus (GLRaV-3)를 대상으로 기내 배양묘를 이용한 바이러스 순화 및 진단효율성을 검토하였다. 바이러스 감염주의 절간을 기내배양하여 증식시킨 기내 배양묘를 1개월 간격으로 계대배양하면서 배양묘를 ELISA 검정한 결과 고농도의 바이러스가 검출되었으며 배양묘의 부위별로 잎, 줄기 및 줄기 유래의 callus 조직에서 모두 고농도로 검출되었다. 또한 포장에서 재배되고 있는 포도나무의 잎이나 엽병조직에 비해 기내 배양묘의 조직을 사용하였을 때 높은 농도의 정제 바이러스를 얻을 수 있었으며, 전자현미경에 의한 dip 검경에서도 사상형 바이러스 입자가 관찰되었다. RT-PCR 진단에서는 기내 배양묘 조직을 사용하였을 때 포도 유엽조직과 엽병+중륵조직에 비해 검출효율이 높았다. 기내 배양묘의 잎조직을 이용하여 ELISA와 RT-PCR 검정감도를 비교한 결과 ELISA에 비해 RT-PCR 검정이 약 1,000배 감도가 높았다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제29권4호
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• pp.357-363
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• 2013

The fungus Venturia nashicola is the causal agent of scab on Asian pears. For the rapid and reliable identification as well as sensitive detection of V. nashicola, a PCR-based technique was developed. DNA fingerprints of three closely related species, V. nashicola, V. pirina, and V. inaequalis, were obtained by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Two RAPD markers specific to V. nashicola were identified by PCR, after which two pairs of sequence characterized amplified region (SCAR) primers were designed from the nucleotide sequences of the markers. The SCAR primer pairs, designated as D12F/D12R and E11F/E11R, amplified 535-bp and 525-bp DNA fragments, respectively, only from genomic DNA of V. nashicola. The specificity of the primer sets was tested on strains representing three species of Venturia and 20 fungal plant pathogens. The nested PCR primer pair specific to V. nashicola was developed based on the sequence of the species-specific 525-bp DNA fragment amplified by primer set E11F/E11R. The internal primer pair Na11F/Na11R amplified a 235-bp fragment from V. nashicola, but not from any other fungal species tested. The nested PCR assay was sensitive enough to detect the specific fragment in 50 fg of V. nashicola DNA.

• 대한수의학회지
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• 제55권2호
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• pp.105-110
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• 2015

A real-time PCR assay using hybridization probe (HybProbe) has been developed to detect Brucella (B.) melitensis strains. The primer and HybProbe sets were designed based on the gap gene of chromosome I with a specific single nucleotide polymorphism of B. melitensis. Specificity of the assay was confirmed by comparison to reference Brucella species and other related strains. In the melting curve analysis, B. melitensis generated a peak at $67^{\circ}C$ unlike those for other Brucella species observed at $61^{\circ}C$. Sensitivity of the assay for B. melitensis ranged from 20 ng to 200 fg of genomic DNA. The ability to identify 94 Mongolian B. melitensis isolates using the real-time PCR assay was identical to that of classical biotyping methods and differential multiplex PCR. These data showed that this new molecular technique is a simple and quick method for detecting B. melitensis, which will be important for the control and prevention of brucellosis.

• 생명과학회지
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• 제24권4호
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• pp.428-436
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• 2014

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법은 등온에서 DNA 주형을 변성시키지 않고 실시하기 때문에, autocycling 가닥 변위 DNA 합성에 의존한다. 그래서 고가의 PCR 장비를 필요로 하지 않고 등온 유지가 가능한 저가의 장비인 항온 수조, 오븐, 온장고 등에서 증폭이 가능하다. 본 연구진은 Streptococcus parauberis의 random primer중에서 5개를 선정하여, 신장도가 높은 2개의 primer를 이용하여 최적 반응온도 및 최적 반응시간, 최적 반응 조건들을 확립하였다. 그리고 기존의 PCR과 LAMP의 민감도의 비교 분석을 측정한 결과, LAMP의 높은 검출 한계를 확인할 수 있었다. 본 논문에서는 non-target DNA의 영향을 받지 않고 등온 조건 하에서 DNA를 증폭시킬 수 있는 LAMP법과 SYBR-green I를 이용하여 시각화시켰으며, 기존의 PCR과 비교 분석함으로써, S. parauberis에 대한 신속하고 정확한 진단법을 확립하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제50권4호
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• pp.245-252
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• 2007

FTA(fault tree analysis)는 system 오류 관리를 위한 정성적/정량적 기법으로 적용되고 있다. FTA를 적용한 PCR의 오류 관리 system의 구축을 위한 시범적 단계로서 PCR 실행의 여러 단계 중 가장 간단한 단계인 '반응액의 제조 및 PCR 기기 사용 단계'를 모델로 하여 분석하였다. PCR 실행시 발생할 수 있는 오류를 연역적 논리 방식에 의해 fault tree의 형태로 규명하였다. Fault tree는 오류 관리의 최상위 요소인 top event를 중심으로 중간 계층을 이루는 intermediate events와 최하위의 요소인 basic events로 세분하여 구성하였다. Top event는 '반응액의 제조 및 PCR 기기 사용 단계에서의 오류'; 중간계층 events는 '기기 유래 오류', '실험행위 유래 오류'; basic events는 '정전상황', 'PCR 기기 선정', '기기 사용 관리', '기기 내구성', '조작의 오류', '시료 구분의 오류'로 분석되었다. 이로부터 top event의 원인 분석 및 중요 관리점을 도출하기 위하여 정성적/정량적 분석을 실시하였다. 정성적 기법으로 minimal cut sets, structural importance, common cause vulnerability를 분석하였고, 정량적 기법으로 simulation, cut set importance, item importance, sensitivity를 분석하였다. 정성적 분석과 정량적 분석의 결과에서 '시료 구분의 오류'와 '기기 조작의 오류'가 제 1중요관리점; '기기 관리의 오류'와 '내구성에 의한 오류'는 제 2중요관리점으로 일치되게 나타났다. 그러나 '정전상황'과 '기기 선정의 오류'는 정성적 분석에서만 중요관리점으로 분석되었다. 특히 sensitivity 분석에서 '기기 관리의 오류'는 사용 시간이 경과함에 따라 가장 중요한 관리점으로 부각되었다. 결론적으로 FTA는 PCR 모델 case에 대한 오류의 원인 분석 및 그 방지를 위한 중요관리점을 제시함에 따라, 궁극적으로 미래에 PCR의 오류 관리 system을 완성할 수 있는 효과적인 방법으로 사료된다.

• 한국환경성돌연변이발암원학회:학술대회논문집
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• 한국환경성돌연변이발암원학회 2004년도 춘계학술대회
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• pp.80-80
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• 2004

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제62권5호
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• pp.406-416
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• 2007

연구배경: 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP)은 인간의 유전자 서열 1000염기에 1개 빈도로 발견되어 인간은 대략 300만개의 유전자 다형성을 가지고 있다. 이 유전자 다형성의 조합결과로 인간의 개체 간 특성들이 결정되는 것으로 이해되고 있다. 이러한 다형성들의 조합양상에 따라 특이 질환에 대한 유전자 감수성 또한 달라지게 되므로 최근에는 많은 질환들과 유전자 다형성들과의 상관관계를 보는 연구들도 활발하게 진행되고 있다. 이러한 SNP분석은 큰 집단을 대상으로 진행되어 지므로 적은 비용으로 정확하게 그리고 대용량으로 분석할 수 있는 방법이 필요하다. 방 법: 대상 환자 89명의 genomic DNA를 가지고서 promotor상에 위치한 -37과 -524 염기부위에서 유전자 다형성을 보이는 것으로 보고되어져 있는 RRM1(ribonucleotide reductase M1) 유전자를 대상으로 PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)와 real-time PCR(RTPCR, TaqMan probe assay)을 동시에 시행한 후 각각의 결과를 비교 분석하였다. 결 과: 대상 DNA 89예 중 -37에서는 2예(2.17%), -524에서는 15예(16.26%)가 서로 다른 양상을 보였다. 결과 차이를 보인 샘플 17예를 대상으로 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 17예 모두 RT-PCR에서 확인되었던 결과와 일치함을 확인할 수 있었다. 추가 샘플 138예를 대상으로 RT-PCR을 2회 연속 실행하여 genotyping을 해 본 결과 98%이상의 높은 일치율을 보였으며, 그중 10예를 무작위로 골라 직접 염기서열 분석을 시행하여 본 결과, 역시 100%일치, 높은 정확도를 보였고 이는 in-tube assay 방식으로 샘플의 오염을 최소화 할 수 있었으며 72 well based system(Corbett Research)을 이용함으로 1회 유전자 증폭반응을 통해 많은 검체를 한 번에 확인할 수 있어 매우 빠른 검사방법 이었다. 결 론: 큰 집단을 대상으로 다량의 SNP를 분석하기 위한 실험 방법으로는 RT-PCR이 신속하면서도 정확한 결과를 얻을 수 있는 방법으로 사료된다.

• 대한임상검사과학회지
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• 제46권4호
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• pp.136-139
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• 2014

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the severe nosocomial infectious agents. The traditional diagnostic methods including biochemical test, antibiotic susceptibility test and PCR amplification are time consuming and require much work. The Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) biosensor is a rapid and powerful tool for analyzing the chemical composition within a single living cell. To identify the biochemical and genetic characterization of clinical MRSA, all isolates from patients were performed with VITEK2 gram positive (GP) bacterial identification and Antibiotic Susceptibility Testing (AST). Virulence genes of MRSA also were identified by DNA based PCR using specific primers. All isolates, which were placed on a gold coated nanochip, were analyzed by a confocal Raman microscopy system. All isolates were identified as S. aureus by biochemical tests. MRSA, which exhibited antibiotic resistance, demonstrated to be positive gene expression of both femA and mecA. Furthermore, Raman shift of S. aureus and MRSA (n=20) was perfectly distinguished by a confocal Raman microscopy system. This novel technique explained that a SERS based confocal Raman microscopy system can selectively isolate MRSA from non-MRSA. The study recommends the SERS technique as a rapid and sensitive method to detect antibiotic resistant S. aureus in a single cell level.