• BMB Reports
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• 제38권4호
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• pp.491-499
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• 2005

DNA-based molecular markers for differentiation of five penaeid shrimps (Penaeus monodon, P. semisulcatus, Feneropenaeus merguiensis, Litopenaeus vannamei and Marsupenaeus japonicus) were developed based on polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and single-stranded conformation polymorphism (SSCP) of 16S ribosomal (r) DNA. Differentiation of P. monodon, P. semisulcatus and L. vannamei can be unambiguously carried out by PCR-RFLP of 16S $rDNA_{560}$ whereas P. semisulcatus and M. japonicus shared a BABB mitotype. These shrimps were successfully discriminated by SSCP analysis of 16S $rDNA_{560}$. Nevertheless, the amplification success for L. vannamei and F. merguiensis was not consistent when tested against larger sample sizes. As a result, 16S $rDNA_{560}$ of an individual representing the most common mitotype of each species was cloned and sequenced. The new primer pair was designed and tested against the large sample sizes (312 bp product, N = 185). The amplification success was consistent across all species. PCR-RFLP of 16S $rDNA_{312}$ was as effective as that of 16S $rDNA_{560}$. Differentiation of all shrimp species were successfully carried out by SSCP analysis.

• 한국축산식품학회지
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• 제37권4호
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• pp.599-605
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• 2017

Korean native honey (KNH) is much more expensive than European honey (EH) in Korea, because KNH is a favored honey which is produced less than EH. Food fraud of KNH has drawn attention of the government office concerned, which is in need of a method to differentiate between KNH and EH which are produced by the Asiatic honeybee, Apis cerana and the European honeybee, Apis mellifera, respectively. A method to discriminate KNH and EH was established by using duplex polymerase chain reaction (PCR) in this study. Immunochromatographic assay (IC) was examined to analyze the duplex PCR product. The DNA sequences of primers for the duplex PCR were determined by comparing cytochrome C oxidase genes of the two honey bee species. Chelex resin method was more efficient in extracting genomic DNA from honey than the other two procedures of commercial kits. The duplex PCR amplifying DNA of 133 bp were more sensitive than that amplifying DNA of 206 bp in detecting EH in the honey mixture of KNH and EH. Agarose gel electrophoresis and IC detected the DNA of 133 bp at the ratios of down to 1% and 5% EH in the honey mixture, respectively and also revealed that several KNH products distributed by internet shopping sites were actually EH. In conclusion, the duplex PCR with subsequent IC could also discriminate between KNH and EH and save time and labor.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권2호
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• pp.280-289
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• 2021

Genetic markers currently used for the discrimination of Lactobacillus delbrueckii subspecies have low efficiency for identification at subspecies level. Therefore, our objective in this study was to select novel genetic markers for accurate identification and discrimination of six L. delbrueckii subspecies based on pangenome analysis. We evaluated L. delbrueckii genomes to avoid making incorrect conclusions in the process of selecting genetic markers due to mislabeled genomes. Genome analysis showed that two genomes of L. delbrueckii subspecies deposited at NCBI were misidentified. Based on these results, subspecies-specific genetic markers were selected by comparing the core and pangenomes. Genetic markers were confirmed to be specific for 59,196,562 genome sequences via in silico analysis. They were found in all strains of the same subspecies, but not in other subspecies or bacterial strains. These genetic markers also could be used to accurately identify genomes at the subspecies level for genomes known at the species level. A real-time PCR method for detecting three main subspecies (L. delbrueckii subsp. delbrueckii, lactis, and bulgaricus) was developed to cost-effectively identify them using genetic markers. Results showed 100% specificity for each subspecies. These genetic markers could differentiate each subspecies from 44 other lactic acid bacteria. This real-time PCR method was then applied to monitor 26 probiotics and dairy products. It was also used to identify 64 unknown strains isolated from raw milk samples and dairy products. Results confirmed that unknown isolates and subspecies contained in the product could be accurately identified using this real-time PCR method.

• Journal of Ginseng Research
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• 제33권1호
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• pp.55-58
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• 2009

Generally, the direct sequencing through PCR is faster, easier, cheaper, and more practical than clone sequencing. Frequently, standard PCR amplification is usually interpreted by mispriming internal or external regions of the target template. Normally, DNA fragments were eluted from the gel using Gel extraction kit and subjected to direct sequencing or cloning sequencing. Cloning sequencing has often troublesome and needs more time to analyze for many samples. Since touchdown (TD) PCR can generate sufficient and highly specific amplification, it reduces unwanted amplicon generation. Accordingly, TD PCR is a good method for direct sequencing due to amplifying wanted fragment. In plants the 5S-rRNA gene is separated by simple spacers. The 5S-rRNA gene sequence is very well-conserved between plant species while the spacer is species-specific. Therefore, the sequence has been used for phylogenetic studies and species identification. But frequent occurrences of spurious bands caused by complex genomes are encountered in the product spectrum of standard PCR amplification. In conclusion, the TD PCR method can be applied easily to amplify main 5S-rRNA and direct sequencing of panax ginseng cultivars.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권11호
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• pp.1841-1847
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• 2008

Vibrio vulnificus is a causative agent of serious diseases in humans, resulting from the contact of wound with seawater or consumption of raw seafood. Several studies aimed at detecting V. vulnificus have targeted vvh as a representative virulence toxin gene belonging to the bacterium. In this study, we targeted the rpoS gene, a general stress regulator, to detect V. vulnificus. PCR specificity was identified by amplification of 8 V. vulnificus templates and by the loss of a PCR product with 36 non-V. vulnificus strains. The PCR assay had the 273-bp fragment and the sensitivity of 10 pg DNA from V. vulnificus. SYBR Green I-based real-time PCR assay targeting the rpoS gene showed a melting temperature of approximately $84^{\circ}C$ for the V. vulnificus strains. The minimum level of detection by real-time PCR was 2 pg of purified genomic DNA, or $10^3$ V. vulnificus cells from pure cultured broth and $10^3$ cells in 1 g of oyster tissue homogenates. These data indicate that real-time PCR is a sensitive, species-specific, and rapid method for detecting this bacterium, using the rpoS gene in pure cultures and in infected oyster tissues.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권3호
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• pp.256-264
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• 2004

본 연구는 벼의 세균병 중 치명적인 흰잎마름병을 유발하는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae를 검출할 수 있는 프라이머를 개발하기 위해 실시하였다. X. o. pv. oryzae str. KACC10331의 hpaA유전자 염기서열로부터 흰잎마름병만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제작하여 중합효소연쇄반응에 사용하였다. 개발된 특이 프라이머는 X. o. pv. oryzae str. KACC10331과 X. campestris pv. vesicatoria, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. citri 그리고 X. axonopodis pv. glycines의 phaA유전자 염기서열의 상동성을 비교하여, 그 중 X. o. pv. oryzae만이 가지는 특이적인 부분을 바탕으로 각각 20-mer인 XOF와 XOR를 제작하였다. 제작된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실시한 결과 반응 후 생성된 단편의 크기는 534-bp였다. 반응 후 생성된 단편은 Southern hybridization을 통하여 Xanthomonas 균주들의 hpaA유전자 존재 여부 및 그 상동성을 비교분석하기 위해 사용하였다. 또한 제작된 프라이머를 이용하여 흰잎마름병에 감염된 벼 잎에서의 검출 여부를 확인하였고 X. o. pv. oryzae의 순수 균주 배양액을 중합효소연쇄반응에 이용하여 검출한계를 검정하였다. 본 연구에서 제작된 프라이머를 사용한 중합효소연쇄 반응 방법은 X. o. pv. oryzae의 검출 뿐만 아니라 흰잎마름병의 발생 예찰에 매우 유용할 것으로 판단 되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.117-123
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• 2003

공시균인 Saccha. erythraea IFO 13426으로부터 VB-C에 의한 erythromycin 생산 유도능이 시사된 바 있으므로, 공시균으로부터 VB-C와 특이적으로 결합하는 autoregulators 및 receptor gene을 탐색하여, EM의 생산 조절 기구를 규명하고자 하였다. 탐색의 일환으로 기존의 Streptomyce속 receptor gene의 공통배열을 primer로 이용하여 PCR을 수행하였고, 예상 크기인 120bp의 단편을 pUC19 vector에 ligation하여 E. coli DH5$\alpha$에 형질전환한 후, plasmid를 분리하여 BamHI을 처리하여 2% agarose gel에 전기영동한 결과, pUC19 (2.7kbp)외에 receptor gene PCR 산물이 120bp위치에 존재하는 것을 확인하였다. 형질전환된 plasmid로 PCR을 수행하여 염기배열을 결정한 후 해석한 결과 Streptomyces sp. 유래의 receptor gene과 유사함을 확인하였다. 따라서 Saccha. erythraea IFO 13426에는 항생물질인 erythromycin의 생산에 관여한다고 추정되는 autoregulator receptor protein을 코드하는 유전자가 존재할 것으로 예상되어 120 bp의 PCR product를 probe로 이용하여 Southern 및 colony hybridization을 통하여 3.2 kbp의 SacI 단편을 가지는 plasmid(pESG)를 제작하였고, 이를 sequencing한 결과, autoregulator receptor protein 유전자가 KpnI과 SalI을 포함하는 영역에 존재한다는 것을 알 수 있었으며 이를 EsgR이라 명명하였다. 유전자 해석 결과, EsgR은 205개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이는 기존의 autoregulator receptor proteins과 비교시 30%이상의 상동성을 나타내었으며, 기존의 autoregulator receptor prorein들이 하부의 항생물질 생합성 유전자들의 제어를 위해 보유하고 있는 helix-turn-helix DNA binding motif를 EsgR이 보유하고 있는 점에서, EsgR은 Saccha. erythraea가 보유하는 autoregulator receptor protein을 code하는 유전자로 추정되었다.

• 생명과학회지
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• 제24권1호
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• pp.1-7
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• 2014

진핵세포의 유전자 발현은 genomic DNA 부위의 프로모터라고 불리우는 지역에 전사인자와 RNA 중합효소가 자리하면서 시작되는 기작이다. 유전자 내의 프로모터를 동정하는 여러종류의 실험 방법들이 있지만, 많은 시간과 노동력이 요구되어진다. 본 연구에서는 Ensembl, NCBI, CpG plot 등과 같은 생물정보학 관련 프로그램들을 활용하여 SETDB1 유전자의 프로모터를 동정하여 클로닝하고자 하였다. PCR 증폭을 수행한 후 얻은 약 2 kb DNA 조각을 SETDB1-P1이라 명명하였으며, PCR 산물은 TA 벡터로 클로닝 후 확인하였으며, 이를 다시 제한 효소 절단을 통하여 pGL3-luc 벡터로 클로닝하였다. 클로닝된 pGL3-SETDB1-P1-luc 플라스미드를 H1299 폐암세포주에 transfection 시킨 후 여러 가지 항암제를 처리하였을 때, taxol, 5-FU, doxorubicin 처리군에서 SETDB1 프로모터 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 실험을 통해 항암제 처리 후 SETDB1 유전자 발현이 조절됨을 확인하였다. 그러므로 bioinformatics 프로그램을 통한 프로모터 동정 및 클로닝 방법을 다른 유전자들에도 적용시킨다면, 유전자 발현 연구에 매우 유용할 것으로 사료된다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 추계학술발표대회 및 bio-venture fair
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• pp.711-712
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• 2000

DNA probe assay comprising a microwell as' solid matrix for the immobilization of streptavidin (SA) and an oligonucleotide with covalently bound fluorecein as detection probe was developed. The insolubilized SA captured the biotinylated DNA product of polymerase chain reaction (PCR), and the product was denatured under a basic condition. The remaining single-stranded DNA on the solid surface was hybridized with the probe for signal generation that was performed based on enzyme-linked immuno -reactions.

• 한국육종학회지
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• 제43권5호
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• pp.448-456
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• 2011

적색 과육 '홍양' 품종에서 차등발현하는 유전자를 찾기 위하여 mirror orientation selection (MOS)과 결합된 suppression subtractive hybridization (SSH) 실험을 수행하였다. 그 결과, 288개의 cDNA clone을 확보하였으며, colony PCR을 통해 192개의 positive clone을 선발하였고, 이들을 sequencing하였다. NCBI/Genbank 데이터베이스의 BLAST 검색를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 30개의 clone에서 기존에 알려진 유전자기능과의 유사성을 확인할 수 있었으며, 10개의 clone이 특이유전자였다. 그 중 3개의 clone(AcF21, AcF42, AcF106)은 과실 후숙과 관련된 ACC-oxidase와 상동성이 있었다. SSH의 결과를 통해 얻어진 이 유전자들의 차등발현양상을 확인하기 위하여 reverse transcription PCR(RT-PCR)과 quantitative real-time PCR(qReal-time PCR) 분석을 실시하였다. qReal-time PCR분석과 RT-PCR분석에서 모두 동일한 결과를 확인할 수 있었으며, 3개 clone 모두 '홍양'에서의 유전자발현수준이 '헤이워드'보다 더 높았다. AcF21은 다른 유전자들보다 가장 높은 발현수준을 나타내었는데, 만개 후 120일과 160일 모두 '홍양'에서의 발현수준이 높았다.