• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권11호
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• pp.1503-1509
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• 2014

With the purpose of facilitating the process of stable strain generation, a shuttle vector for integration of genes via a double recombination event into two ectopic sites on the Sulfolobus acidocaldarius chromosome was constructed. The novel chromosomal integration and expression vector pINEX contains a pyrE gene from S. solfataricus P2 ($pyrE_{sso}$) as an auxotrophic selection marker, a multiple cloning site with histidine tag, the internal sequences of malE and malG for homologous recombination, and the entire region of pGEM-T vector, except for the multiple cloning region, for propagation in E. coli. For stable expression of the target gene, an ${\alpha}$-glucosidase-producing strain of S. acidocaldarius was generated employing this vector. The malA gene (saci_1160) encoding an ${\alpha}$-glucosidase from S. acidocaldarius fused with the glutamate dehydrogenase ($gdhA_{saci}$) promoter and leader sequence was ligated to pINEX to generate pINEX_malA. Using the "pop-in" and "pop-out" method, the malA gene was inserted into the genome of MR31 and correct insertion was verified by colony PCR and sequencing. This strain was grown in YT medium without uracil and purified by His-tag affinity chromatography. The ${\alpha}$-glucosidase activity was confirmed by the hydrolysis of $pNP{\alpha}G$. The pINEX vector should be applicable in delineating gene functions in this organism.

• 한국콘텐츠학회논문지
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• 제21권4호
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• pp.825-832
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• 2021

본 연구는 치주질환의 주 원인균인 P. gingivalis에 선택적으로 작용하는 특이적 앱타머를 선별하고 선별된 앱타머와 결합하는 단백질 분자를 정제 및 동정함으로써 P. gingivalis에 관한 작용기전을 규명하고자 하였다. 이를 위하여 39개의 random sequence를 갖는 DNA library를 제조하여 SELEX 방법을 이용하여 P. gingivalis에 특이성을 가진 앱타머를 선별하였으며 PCR2.1 cloning vector를 활용한 cloning을 시행하여 염기서열을 분석했다. 8종의 각기 다른 염기서열을 가진 앱타머를 선별하였고 직접적으로 작용하는 단백질을 밝혀내고자 선별된 앱타머 중 APG-3를 이용하여 modified weston blot을 시행하고 단백질을 분석한 결과 P. gingivalis에 선택적으로 결합하는 11종의 단백질을 분리, 동정하였다. 이와 같은 결과로 앱타머가 치주질환의 원인균인 P. gingivalis의 당 대사 및 세포활성억제와 관련된 단백질에 선택적으로 결합하여 부착함으로써 치주질환의 진단을 위한 센서로 가능성을 제시했다.

• BMB Reports
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• 제38권2호
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• pp.191-197
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• 2005

Although the human genome has been nearly completely sequenced, the functions and the roles of the vast majority of the genes, and the influences of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in these genes are not entirely known. A modified mutation detection method was developed for large-scale cloning of the possible SNPs between tumor and normal cells for facilitating the identification of genetic factors that associated with cancer formation and progression. The method involves hybridization of restriction enzyme-cut chromosomal DNA, cleavage and modification of the sites of differences by enzymes, and differential cloning of sequence variations with a designed vector. Experimental validations of the presence and location of sequence variations in the isolated clones by PCR and DNA sequencing support the capability of this method in identifying sequence differences between tumor cells and normal cells.

• Journal of Microbiology
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• 제44권5호
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• pp.515-522
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• 2006

A cDNA library of Ganoderma lucidum has been constructed using a Zap Express cloning vector. A glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpd) was isolated from this library by hybridization of the recombinant phage clones with a gpd-specific gene probe generated by PCR. By comparison of the cDNA and the genomic DNA sequences, it was found that the complete nucleotide sequence encodes a putative polypeptide chain of 338 amino acids interrupted by 6 introns. The predicted amino acid sequence of this gene shows a high degree of sequence similarity to the GPD proteins from yeast and filamentous fungi. The promoter region contains a CT-rich stretch, two CAAT boxes, and a consensus TATA box. The possibility of using the gpd promoter in the construction of new transformation vectors is discussed.

• 생명과학회지
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• 제24권1호
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• pp.1-7
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• 2014

진핵세포의 유전자 발현은 genomic DNA 부위의 프로모터라고 불리우는 지역에 전사인자와 RNA 중합효소가 자리하면서 시작되는 기작이다. 유전자 내의 프로모터를 동정하는 여러종류의 실험 방법들이 있지만, 많은 시간과 노동력이 요구되어진다. 본 연구에서는 Ensembl, NCBI, CpG plot 등과 같은 생물정보학 관련 프로그램들을 활용하여 SETDB1 유전자의 프로모터를 동정하여 클로닝하고자 하였다. PCR 증폭을 수행한 후 얻은 약 2 kb DNA 조각을 SETDB1-P1이라 명명하였으며, PCR 산물은 TA 벡터로 클로닝 후 확인하였으며, 이를 다시 제한 효소 절단을 통하여 pGL3-luc 벡터로 클로닝하였다. 클로닝된 pGL3-SETDB1-P1-luc 플라스미드를 H1299 폐암세포주에 transfection 시킨 후 여러 가지 항암제를 처리하였을 때, taxol, 5-FU, doxorubicin 처리군에서 SETDB1 프로모터 활성이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 실험을 통해 항암제 처리 후 SETDB1 유전자 발현이 조절됨을 확인하였다. 그러므로 bioinformatics 프로그램을 통한 프로모터 동정 및 클로닝 방법을 다른 유전자들에도 적용시킨다면, 유전자 발현 연구에 매우 유용할 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제41권1호
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• pp.87-92
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• 2005

방선균 Streptomyces griseus에서 상업적 목적으로 생산되는 protease인 protease는 serine protease, alkaline protease, aminopeptidase및 carboxypeptidase로 구성되어 있는 복합체로서 의 약용 소염제로 널리 사용되어지고 있다. 본 연구에서는 기존에 개발되어 있는 방선균용 integration vector인 pSET152로부터 목적산물의 대량발현을 위해 방선균용 promoter ermE가 cloning된 새로운 integration vector인 pHJ101을 개발하였고, pretense의 생산량 증대에 사용하였다. 새로 개발된 integration vector에 S. griseus protease A를 코드하고 있는 유전자, sprA와 S. griseus pretense B유전자, sprB를 각각 cloning하여 plasmid pHJ201과 pHJ202를 구축하였다. 이들 plasmid들을 S. griseus IFO 13350에 형질전환하여 발현용plasmid가 chromosome에 integration된 재조합 균주 S. gliseus HA와 S. griseus HB를 얻었다. 이들 재조합균주로부터 전체 protease의 생산량을 확인한 결과, 모균주보다 각각 S. griseus HA는 약 5.3 배, S. griseus HB는 약 5 배 정도 생산량이 증대되었다. 이들 결과로부터 특정유전자의 고발현용 integration vector의 제작이 확인되었으며, 전체 protease의 생산량 증대의 가능성이 시사되었다.

• 대한의생명과학회지
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• 제8권3호
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• pp.107-113
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• 2002

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains of serotype O157:H7 have been shown to colonize the intestinal epithelial cell by the attaching and effacing (AE) mechanism. The AE lesion is mediated by an intimin, of which production and expression are controlled by a 3-Kb eaeA gene located EHEC chromosomal DNA. If the eaeA gene is mutated, EHEC O157:H7 strains lose capacity of adhesion to intestinal epithelial cells. In this study, a 891 bp of the 3'-end region of a gamma intimin was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product was inserted into pSTBlue-1 cloning vector and transformed into DE3 (BL21) competent cell. After plasmid mini-preparation and restriction enzyme digestion of eaeA/891-pSTBlue-1 vector, target eaeA gene was re-inserted into pET-28a expression vector and was transformed. Then the expression of recombinant eaeA/891 (891 bp) gene was induced by isopropyl-$\beta$-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of the 40-KDa recombinant protein was identified in SDS-PAGE and confirmed by immunoblotting using the His.Tag$^{\circledR}$ and T$_{7}$.Tag$^{\circledR}$ monoclonal antibody. This recombinant protein expressed by eaeA gene could be applied in further studies on the mechanisms of E. coli O157:H7 infection and the development of recombinant vaccine.

• 생명과학회지
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• 제24권12호
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• pp.1269-1275
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• 2014

TALEN은 특정유전자를 표적 하여 knock-out 시킬 수 있는 새로운 개념의 유전자 클로닝 방법이다. TALEN 플라스미드에는 DNA binding 도메인과 Fok1 절단효소 기능이 융합되어 있기 때문에, genomic DNA 의 어느 부위라도 결합할 수 있고, 표적 염기서열을 절단하여 유전자 돌연변이를 유도할 수 있다. 본 연구에서 우리는 SETDB1 HMTase 유전자의 단백질 개시코돈 과 프로모터 -25 upstream 부위를 표적 하는 두 종의 TALEN constructs 를 제작하였다. 이를 위하여 두 단계의 클로닝이 진행되었다. 첫 번째는 모듈벡터에서 pFUS배열벡터로 표적서열을 옮겨 콜로니 PCR을 통해 smear밴드와 Esp1 제한 효소를 이용하여 약 1 kb의 insert가 들어 있음을 확인하였다. 두 번째는 배열 벡터로부터 TALEN 발현벡터로 옮기는 과정을 진행하였으며, 염기서열분석을 통해 확인하였다. 그 결과 최초의 고안된 모듈벡터 서열들이 약 100 bp 간격으로 배열되어 있음을 확인하였다. 제작된 TALEN-DBEX2 construct는 transfection을 통해 SETDB1의 발현이 사라지는 것을 확인하였고, T7E1 분석을 통하여 표적부위에서 돌연변이가 발생하였음을 추정할 수 있었다. 한편, TALEN-DBPR25 transfection을 통하여서도 SETDB1의 발현이 감소하는 현상을 확인 하였다. DBEX2, DBPR25를 이입시킨 HeLa 세포에서 세포 형태가 길어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 그러므로 단백질 개시코돈 또는 -25 upstream을 표적 하는 TALEN knock-out 방법은 SETDB1 유전자의 기능연구에 매우 유용하다고 사료된다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제46권4호
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• pp.555-562
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• 2004

본 연구는 목저은 다음과 같다: 1) 돼지에서 150-kDa temary insulin-like growth faetor(IGF)complex의 한 구성 요소인 acid-labile subunit(ALS) 유전자 intron의 존재 확인. cloning 및 돼지 ALS(porcine ALS; pALS) complementary DNA(cDNA)의 3' 비해독(untranslated) 부위(3' UT) 증폭. cloning, 2) intron-spanning primer pair를 이용한 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법에 의한 돼지 조직에서의 ALS 유전자 발현 분포 확인 및 3) 돼지 hepatocyte에서의 ALS 유전자 발현 여부 확인. 돼지 genomic DNA를 template로 하여 PCR 방법으로 예상된는 intron 부위를 증폭하고 plasmid vector에 삽입하여 염기서열을 결정한 결과 타 종의 ALS 유전자에서와 같은 위치에 1,371-base pair(bp)의 pALS intron이 존재함을 확인하였다. 역시 본 연구에서 간에서 추출한 RNA를 주형으로 시작하여 3' rapid amplification of cDNA end(3' RACE) 방법으로 147-bp의 3'UT를 합성하고 그 염기성열을 결정하였다. RT-PCR 결과 간은 물론 조사된 모든 돼지의 내장기관(신장, 폐, 비장)과 자성 생식기관(난소, 난관, 자궁) 및 골격근육에서 ALS 유전자가 발현됨이 밝혀졌다. 또한 돼지 간 조직에 대한 in-situ hybridization 결과 hepatocyte에서 ALS 유전자가 발현됨이 확인되었다. 이상의 결과는 ALS가 혈중 IGF의 저정/조절체로서의 주기능 외에 모세혈관 밖에서도 미지의 기능이 있을 기능성을 시사한다.

• 한국동물위생학회지
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• 제27권1호
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• pp.103-109
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• 2004

Babesia equi ema-1 5' intergenic(IG) nucleotide was PCR amplified and analyzed for restriction sites in order to identify a promoter region in this IG nucleotide sequence. B equi ema-1 5' IG specific primers identified a 1268 bp PCR product. The sequence had restriction sites for 34 restriction enzymes when analyzed by a computer program. Among them, 26 enzymes had only one restriction site, but the others had more than one sites. When four restriction enzymes (Bgll , HindⅢ, Kpn1 and BamH1) were treated to digest the 1268 bp nucleotide, they had restriction sites as expected by the computer program. Information of restriction sites in the 1268 bp IG nucleotide will be applied to select restriction enzymes for cloning the IG nucleotide to a vector.