• 한국동물생명공학회지
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• 제34권4호
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• pp.259-266
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• 2019

Emulsion polymerase chain reaction (PCR) is performed on compartmentalized DNA, allowing a large number of PCR reactions to be carried out in parallel. Emulsion PCR has unique advantages in DNA amplification. It can be applied in many molecular biological assays, especially those requiring highly sensitive and specific DNA amplification. This review discusses the principle of emulsion PCR and its applications in biotechnology. Related technologies are also discussed.

• 미생물학회지
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• 제43권1호
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• pp.23-30
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• 2007

조류 인플루엔자바이러스(AIV) H5N1 아형을 Real-time PCR법을 이용하여 가장 빠르게 진단할 수 있는 방법을 개발하였다. 검색 대상의 염기서열은 AIV H5N1 아형의 hemagglutinin 유전자 중 가장 상동성이 높은 387 bp의 부위를 선택하였고, 실험의 안전을 위하여 인공합섬의 방법으로 제작하였다. Microchip을 기반으로 한Real-time PCR법을 사용하였으며, 총PCR 반응액의 양을 $1{\mu}l$로, PCR 과정 중 각 단계, 즉 해리, 접합, 신장의 시간을 각1초, 1초, 3초로 하여 총 실험시간을 단축하였다. 진단을 위한 실험과정에서 PCR 및 융점분식에 소요된 최단 시간은 12분28초였으며, 민감도측정에서 최소2.4개의 hemaggutinin 유전자를 기질로 하여 목적한 특이 189 bp의 PCR 산물을 증폭할 수 있었기에, 본 연구에서는 이런 초고속 PCR 실험방식을 Quick Real-time PCR이라 명명하였다. 이 결과들은 가금류 및 사람에게 전파된 AIV H5N1아형의 진단에 적용될 수 있을 뿐 아니라, PCR이 사용되는 다른 신속검색법에도 널리 적용 될 수 있을 것으로 기대한다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제41권1호
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• pp.42-46
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• 1998

본 연구는 polymerase chain reaction (PCR)와 Southern hybridization을 이용하여 서로 붙어있는 나무가 한 나무인지 두 나무인지 규명하였다. 공시된 수종은 구지뽕나무와 무궁화이다. 구지뽕나무는 경상북도 성주군 금수면 봉두리 안새출 금수식당 앞에 있는 나무로 두 사람이 서로 안고 있는 형상인데, 한 나무의 두 가지인지 가까이 자란 두 나무가 붙었는지를 구별하기 어려운 나무였다. 다섯 종류의 PCR primer $(17{\sim}24-mers)$ 중 355 primer의 경우 한가지의 잎 DNA에서만 PCR 산물이 검출되어 이것을 방사선표지한 후 genomic Southern hybridization을 행하였던 바 이 probe와 결합하는 DNA 단편이 동일한 위치에서 검출되었으나 정도는 다르게 나타났다. 아울러 OPERON 10-mer kits A에 있는 20종류의 primer를 이용하여 PCR을 행한 결과 OPA01 primer (CAGGCCCTTC)에 의한 PCR 생성물은 동일한 위치의 band 뿐만 아니라 추가로 4개가 한가지의 잎 DNA에서 더 나타났다. 따라서 구지뽕나무는 두 나무가 연결되어 한 나무를 이루는 것으로 짐작된다. 또한 무궁화는 경상남도 합천군 청덕면 두곡리 청덕초등학교 내에 있는데 수령 50년 이상으로 멀리서 보면 한 나무의 형상을 하고 있으나, 가까이 다가가서 줄기의 아래부분을 보면 세 줄기가 붙어있는 형상을 하고 있다. 따라서 이 무궁화 역시 한 나무의 세 가지인지 세나무가 가까이 자라 붙었는지 PCR과 Southern hybridization 방법을 이용하여 규명하려 하였다. Southern hybridization 결과에 의하면 구지뽕나무의 분석에 사용한 probe와 결합하는 DNA 단편은 검출되지 많았으며, 35S primer에 의한 PCR 생성물은 동일하였으나 OPA04와 OPA13 primer의 경우 약간의 상이성을 보였다. 이러한 결과에 따라 무궁화는 한 나무의 세 가지인 듯하나 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.

• 대한화학회지
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• 제51권1호
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• pp.36-42
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• 2007

B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)는 만성감염, 간암의 원인이 되는 등 가장 큰 공중보건문제 중의 하나이다. 그리하여 감염 초기에 바이러스의 DNA 농도를 측정하여 관찰 하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 기존의 Real Time-PCR과 새로운 방법인 Micro-PCR를 이용하여 HBV를 검출하였다. 단국대학교 병원에서 HBV 감염 환자의 혈청 샘플 120개를 얻은 후 분석하였고 각각 장비에서의 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성, 분석시간을 비교해 보았다. 그 결과 Micro-PCR과 Real-Time PCR은 높은 검출한계와 재현성, 민감성, 특이성을 가지고 있었다. 그러나 Micro-PCR은 Real-Time PCR보다 빠른 시간 안에 증폭이 가능하며 조작하는데 있어 간편하였고 적은 양의 시약이 소모됨을 알 수 있었다. 그러므로 Micro-PCR은 신뢰성 있고 빠른 임상적 진단이나 각종 검사가 요구되는 곳에서 이용 가치가 높은 장비라 할 수 있겠다.

• 미생물학회지
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• 제44권3호
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• pp.203-211
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• 2008

Shiga 독소 생성 대장균(Shiga toxin-producing Escherichia coli; STEC)을 가장 빠르게 검출할 수 있는 초고속 이단계 PCR 방법을 개발하였다. 검색 대상 유전자는 STEC에서 생성되는 Shiga 독소(Shiga toxin; Stx)를 암호화하고 있는 유전자 stx1이며, 1쌍의 stx 유전자 특이 primer를 사용하여 검출을 수행하였다. 초고속 PCR (Ultra-rapid PCR)은 microchip 기반의 6 ${\mu}l$ PCR 용량의 Real-time PCR을 사용하고, PCR 회전의 각 단계 중 혼성과 중합을 한 단계로 하였을 뿐 아니라, 각 단계의 적용시간을 각 1초, 3초(해리, 혼성/중합)가 되게 극단적으로 줄여, 검사소요시간을 최소화하였다. 35회전의 PCR 진단에 사용된 시간은 6분38초였으며, 용융온도분석에서 stx1 특이 유전자가 검출되었음을 확인하는 데까지 총 7분 28초가 소요되었다. 또한 민감도 측정에서 $3{\times}10^0$ CFU/reaction까지 성공적으로 검출 가능함이 확인되었고, 용융온도분석에서 이 증폭산물은 일정한 $81.42{\pm}0.34^{\circ}C$의 용융온도를 갖는 것으로 확인되었다. 이 검사법을 다양한 STEC 균주들에게 적용하여 그 성능을 검증하였으며, 이로써 본 초고속 이단계 PCR 방법은 Shiga 독소 생성 대장균의 초신속 검출에 바로 적용될 수 있을 것으로 기대한다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제42권5호
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• pp.695-702
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• 1995

연구 배경: 결핵성 흉막삼출은 아직까지도 우리나라에서 가장 흔한 흉막삼출 원인으로 생각되고 있으나 기존의 검사로는 60% 정도의 확진만이 가능하다. 이에 보다 예민한 진단법의 개발이 요구되던 중 PCR의 발전으로 결핵성흉염의 진단에 도움을 줄 것으로 기대되었다. 여에 저자들은 PCR을 이용한 결핵성 흉막염 진단의 유용성을 알아보고자 하였다. 방법: 환자군으로 결핵성 흉막염으로 확진된 경우와 임상적으로 결핵성 흉막엽으로 의심이된 각각 7명의 선정하였고 대조군으로 결핵의 과거력이 없었던 7명의 악성종양 환자의 흉수를 각각 사용하여 PCR을 시행하였으며, PCR의 target은 IS6110 gene의 일부인 123bp DNA로 하였고 DNA추출은 Eisennach 방법(1991)을 변형하여 사용하였다. 결과: 1) PCR의 감수성검사에서 자외선 발광경하에서 50fg DNA에서 양성 임을 확인하였다. 2) 조직병리학적 및 미생물학적 방법으로 확진된 결핵성 흉막염 환자중 85.7%(6/7)에서 PCR양성을 나타내었고, 임상적으로 결핵성 흉막염이 의심된 환자중 71.5%(5/7)에서 PCR 양성을 나타내었다. 3) 대조군 7예는 모두 PCR 음성이었다. 결론: 이상의 결과로서 결핵성 흉막액의 진단에 있어서 IS6110을 이용한 PCR법은 고식적인 진단방법에 비하여 결핵균의 신속하고 정확한 진단을 가능하게 해주는 유용한 방법임을 알 수 있었으나 비용을 절감할 수 있고 오염을 줄일 수 있는 방법에 대한 연구가 더 필요하리라 생각된다.

• 미생물학회지
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• 제41권1호
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• pp.24-37
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• 2005

국내 사육 하우 염소, 돼지, 개, 닭 및 마우스 등을 포함한 각종 동물과 사람환자에서 분리한 총 116주의 S. aureus 분리주에 대해서 5종의 PCR 기법을 적용하여 분자역학적 특성을 분석하였다. 먼저 종특이 유전자(SSG: aroA, coa, nuc 및 spa-gene)의 다양성을 PCR 기법으로 조사하였고, 또한 약제내성의 MRSA 균주의 분포양상과 내독소(Enterotoxin)산생유전자(SE)의 분포양상에 대해서도 조사하였다. 그리고 이 연궁선 수행한 5종의 PCR 기법 들이 생산한 개별성적을 객관적으로 비교하여, 가장 신뢰도 높고 효율적 PCR기법을 선발하였다. 먼저 PCR기법을 적용한 SSG의 분포양상 조사에서는 $nuc-gene\;(100\%)$, $spa-gene\;(91.4\%)$, $coa-gene\;(87.9\%)$, 및 $aroA-gene\;(26.7\%)$의 빈도로 조사되었다. 그리고 aroA와 coa-gene PCR 증폭산물에 대한 RsaI과 AluI 효소로 소화시킨 RELP 성적에서 coa-Bene PCR-RFLP에서는 모두 10 type의 con-type이 동정되었고, 그중 coa-3 type (809 bp)이 닭, 마우스, MRSA 및 사람유래 균주를 포함한 총 36주 $(33.0\%)$로서 가장 대표적인 genotype으로 결정되었다. 반면에 aroA-gene PCR-RELP에서는 단지 7 type의 genotype만이 산생되어 대조를 보였고, 17주 $(73.9\%)$가 대표적인 그룹으로 분류되었다. 한편 spa-gene PCR에서는 총 11 type의 spa-type이 확인되었고, 그중 spa-7 type (9 repeats; 263 bp)이 한우, 닭, 개, 염소, 마우스 및 MRSA 균주 등을 포함한 총 39주 $(34.8\%)$로서 가장 대표적인 genotype으로 결정되었다. 또한 총 116주에 대해 MRSA 균주의신속한 검출을 위해서 mecA-gene PCR을 적용하였던 바, 단지 사람유래의 14주 $(12.1\%)$에서만 양성의 증폭산물 (533 bp)이 검출되었고, 이들 증폭된 PCR산물의 유전학적 검증을 위해 HhaI으로 소화시켰던바 14주 모두 $(100\%)$가 알려진 2개의 DNA band (332 & 201 bp)로 양분되어 유전자수준에서 MRSA 양성균주로 검증되었다. 한편 내독소 산생유전자 (SE-gene)는 multiplex-PCR기법으로 조사하였으며 sea-gene $(63.7\%)$이 가장 지배적이었고, 이어서 seb-gene $(10.0\%)$ 및 sec-gene $(7.2\%)$의 순서였다. 특히 sea+sec의 2종의 SE genes를 보유한 균주도 11주로서 가장 많았으며 그 외에도 sea+seb (2주)및 seb+see (1주) genes를 보유한 균주도 함께 검출되었다. 최종적으로 5종의 PCR기법들이 생산한 성적들을 수치 (SID)로 변환하여 객관적으로 감별능력 (DA)을 비교하였던바, aroA-gene PCR-RFLP는 가장 저조한 DA [SID=0.462]을 나타내었고, 반면에 coa-gene PCR-RELP는 5종의 분석기법 중에서 가장 신뢰도 높은 DA [SID=0.894]을 발현하였다. 따라서 현재의 연구결과con-gene PCR-RELP기법이 사람을 포함한 다양한 동물종유래 S. aureus 균주들의 유전학적 분석목적에 가장 신뢰도 높고 감별능력이 뛰어난 분석기법으로 선발되었다.

• 한국수의병리학회:학술대회논문집
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• 한국수의병리학회 2002년도 추계학술대회초록집
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• pp.139-139
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• 2002

돼지 설사유발 칼리시 바이러스(Porcine enteric calicivirus: PECV)도 자돈에서 설사를 일으키는 바이러스로 이미 알려졌다. RT-PCR과 nested PCR을 이용하여 국내 양돈장에서 PECV의 발생을 조사하고자 본 연구를 시도하였다. 설사 분변은 경기, 충남, 전북, 전남과 제주지역에 분포한 31개의 농장 102마리의 자돈에서 채취하여 의뢰된 것을 조사하였다. RT-PCR 과 nested PCR 을 위하여 RNA dependent RNA Polymerase (RDRP) 부위와 capsid 부위에서 각각 2 쌍의 primer를 작성하였다. RDRP 부위에서 RT-PCR을 시행했던 바, 3마리 (2.9％) 에서, nested PCR에서는 18마리 (17.6％)에서 양성반응이 나왔으며 capsid 부위에서 RT-PCR 결과 5마리 (4.9％), nested PCR에서는 18마리(17.6％)가 양성반응으로 확인되었다. 본 연구를 통하여 PECV가 국내에서 돼지 설사를 일으키는 주요 원인체 중 하나라는 것이 밝혀졌으며, nested PCR 기법이 돼지 설사분변에서 PECV를 검출하는 좋은 진단방법이었다.

• 대한수의학회지
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• 제45권2호
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• pp.199-205
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• 2005

DNA fingerprint patterns of 8 Brucella reference strains and 15 B. abortus field isolates were characterized by repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR) using BOX- and ERIC-primers in this study. AMOS PCR differentiated all Brucella field isolates from B. abortus RB51, a vaccine strain by producing a B. abortus-specific 498 bp band. Rep-PCR using BOX-primer produced 13 to 18 bands with sizes of between 230 and 3,300 bp, and discriminated Brucella strains to the species level except B. canis and B. suis. PCR products amplified with ERIC primers were, however, not appropriate for differentiating the Brucella isolates. DNA fingerprint patterns for all B. abortus field isolates were identical among them and were put on one cluster with B. abortus biovar 1 reference strain in the dendrogram, indicating they were highly clonal. These results suggested that rep-PCR using BOX primer might to be a useful tool for calculating genetic relatedness among the Brucella species and for the study of brucellosis epidemiology.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권11호
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• pp.1858-1861
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• 2008

A PCR-enzyme-linked immunosorbent assay (PCR-ELISA) was developed for the rapid and sensitive detection of L. monocytogenes. PCR primers generating a 132-bp amplicon and a capture probe able to hybridize to the PCR amplicon were designed based on the L. monocytogenes-specific hly gene encoding listeriolysin. The detection limit of PCR-ELISA for L. monocytogenes was determined to be as low as 10 cells per PCR reaction, and this level of detection was achieved within 5 h. These results indicate that the PCR-ELISA provides a valuable tool for the rapid and sensitive detection of L. monocytogenes for the ready-to-eat food industry.