• Pediatric Infection and Vaccine
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• 제23권3호
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• pp.194-201
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• 2016

목적: 폐렴구균은 주요 비인두 상재균으로, 주위 조직을 침범하여 침습성 감염을 일으킬 수 있어 보균율에 대한 감시가 중요하다. 본 연구에서는 임상에서 비인두 흡인물로부터 추출하고 남은 RNA를 이용하여 폐렴구균을 확인할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time reverse transcription polymerase chain reaction [RT-PCR])법을 구축하고, 보균율 측정에 있어서의 정확성과 이점을 확인하고자 하였다. 방법: 2014년 9월부터 10월까지 중앙대학교병원에 입원하여 호흡기 바이러스 RT-PCR 검사를 시행받은 18세 이하의 소아들로부터 비인두 흡인물을 채취하였다. 먼저 배양법과 genomic DNA (gDNA)를 이용한 real-time PCR을 시행하여 폐렴구균 검출률의 정확성을 확인하였다. 이 중 처음 20개의 검체를 이용하여, 고전적인 배양법과 gDNA를 이용한 real-time PCR, 그리고 RNA를 이용한 real-time RT-PCR법을 시행하고 이를 비교 분석하였다. 결과: 총 157개의 검체에서 시행한 real-time PCR 검사는 기존의 배양검사와 일치율이 0.922 (P<0.01, Fisher exact test)로 매우 높았다. 배양검사에서 음성인 133개의 검체는 real-time PCR에서도 모두 음성을 보였다. 24개의 배양 양성 검체 중 21개의 검체는 real-time PCR에서도 양성이었지만, 나머지 검체는 음성 결과를 보였다. 20개의 검체에서 시행한 real-time RT-PCR 검사는 1개 검체를 제외하고 배양법 및 real-time PCR과 결과가 일치하였다. 한편, 배양법을 시행하고 결과를 확인하기까지는 총 26.5시간, real-time RT-PCR 검사에는 총 4.5시간이 소요되었다. 결론: 본 연구는 비인두 집락균 확인을 위한 real-time RT-PCR법의 확립과, 폐렴구균 보균율 측정에 있어서의 real-time RT-PCR 검사의 정확성 및 편의성을 보여주었다. Real-time RT-PCR 검사법은 주요 세균들의 보균율 연구에 있어서 시간과 노력을 줄일 수 있는 좋은 방법이며, 폐렴구균의 역학자료 수집에 큰 도움이 될 것으로 기대한다.

• 생명과학회지
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• 제16권5호
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• pp.729-733
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• 2006

크립토스포리디움의 활성 및 감염성 판정을 위해 Direct RT-PCR, 세포배양 후 RT-PCR 및 면역형광염색법을 비교한 결과는 다음과 같다. 1) 크립토스포리디움의 HSP70 gene에 대해 direct RT-PCR한 결과, 민감도가 매우 높아 저농도로 존재하는 환경시료에서의 크립토스포리디움 활성을 모니터링하는데 장점이 있을 것으로 보이나, 감염성의 판정은 알 수 없으며, 정량화가 안되는 단점이 있었다. 2) ${\beta}-tubulin$ gene에 대해 RT-nested PCR을 한 결과 크립 토스포리디움의 난포낭이 $1{\times}10^4$ 세포수정도 되어야 검출이 되는 것으로 나타나 HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교할 때 10,000배 이상 민감도가 떨어지는 것으로 나타났다. 3) 세포배양 후 RT-PCR 또는 면역형광염색법을 이용할 경우에는 민감도가 direct RT-PCR보다 다소 떨어지는 단점이 있었으나 크립토스포리디움의 오염원이나 오염이 심한 지역의 감염성 조사에 적합할 것으로 나타났으나, 정량화가 필요한 경우에는 세포배양 후 면역형광염색법이 효과적일 것으로 나타났다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제29권1호
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• pp.31-39
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• 2014

본 연구에서는 FCV 현탁액에 물리, 화학적 위생처리 후 복합효소처리라는 전처리과정을 적용한 뒤 real-time RT-PCR법을 이용하여 살균효능을 분석하였다. RT-PCR 이전에 $37^{\circ}C$에서 30분 동안 PK와 RNase A를 처리함으로써 UV, 열, 염소, 에탄올, 과초산계열 제품에 의해 불활성화 된 바이러스들은 음성 결과를 나타내었고, real-time RTP-CR법을 통해 살균 효능을 정량분석한 결과, 복합효소처리를 했을 경우 무처리구보다 더 높은 살균 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이로써 Nuanualsuwan S. 등의 선행연구에서와 같이 PK와 RNase A로 전처리하는 단계를 통하여 물리, 화학적 위생처리에 의해 손상되지 않은 바이러스가 RT-PCR법에 의해 증폭되는 것을 방지함으로써 Real-time PCR법에 대한 검출 감도를 높일 수 있음을 확인하였다. 또한, FCV를 검출하기 위해 사용된 RT-PCR과 real-time RT-PCR 두 방법 중에서도 real-time RT-PCR법이 가장 신속하면서도 민감도 높은 결과로 도출되었다. 따라서, 유전자 분석 이전에 복합효소처리는 물리, 화학적 위생처리에 의해 불활성화 된 바이러스의 RNA가 transcription 또는 증폭되는 것을 방지하기 위한 수단으로 real-time RT-PCR법과 결합됨으로써 노로바이러스를 비롯한 식중독 바이러스를 검출하는데 효과적으로 적용될 것으로 판단된다. 또한 식품현장에서 전기영동 과정없이 신속하게 살아있는 바이러스만을 수치적으로 정량화함으로써 식품안전에도 기여할 것으로 사료된다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제16권4호
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• pp.251-257
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• 2001

Listeria monocytogenes와 L. ivanovii는 인간과 동물에 대한 식품 유래성 병원성 세균이다. Listeria 속에는 이들 병원균 외에 비병원성세균인 L. innocua, L, welshimeri, L. seeligeri, L.grayi 등 이 포함되어 있기에, 식품검사에서 배양법을 사용하는 종래의 Listeria의 검출방법은 시간과 많은 실험을 필요로 한다. 이런 이유 등으로 Literia의 종동정과 검출을 위한 신속한 검출법으로 Lis-mix multiplex PCR검출법 (Bubert et al., 1999)이 개발되었다. 본 연구에서는 식품검사에 활용하기 위한 실용적인 Lis-mix multiplex PCR 방법을 개발하고, 아울러 새로운 Siw-mixIII PCR 검출법을 개발하였다. 이 방법을 사용하여 식품에서 분리된 총 69개의 Listeria 균주를 성공적으로 종동정할 수 있었으며, Siw-mixIII multiplex PCR방법을 사용하여 L. ivanovii, L.welshimeri, L.seeligeri를 한번의 PCR로 검출 및 종동정을 할 수 있었다.

• 한국균학회지
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• 제44권2호
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• pp.103-107
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• 2016

본 연구는 국내 주요 식물검역관리 대상 Phytophthora pinifolia를 대상으로 신속하고 정확한 병원균 종동정 및 검출을 위해 Ypt1 유전자 염기서열을 활용하여 제작된 종 특이적 분석용 분자마커와 다양한 PCR 기법을 활용하여 병원균들에 대한 다양한 검출기술의 표준화 및 최적 검출 시스템 구축을 통하여 실제 검역검역 현장에서 활용 가능한 병원균 존재여부의 신속, 정확한 판별기법을 개발하고자 수행하였다. Ypt1 영역의 염기서열을 기초로 선발된 종 특이적 primer는 1~10 pg의 검출민감도를 가지며 193 bp의 종 특이적 PCR 증폭산물을 형성시켰다. 또한 선발된 종 특이적 primer의 종 특이성을 확인하기 위하여 국내 식물검역대상에 포함된 Phytophthora속 종들과 주요 식물병원균들을 대상으로 conventional PCR과 real-time PCR을 수행한 결과 목표로 한 P. pinifolia DNA에서만 특이적 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다. 선발된 종 특이적 primer에 대한 PCR의 검출 민감도를 확인했을 때 conventional PCR의 검출민감도는 1~10 pg이었다.

• 한국동물위생학회지
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• 제32권4호
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• pp.299-306
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• 2009

Assay for the detection and quantification of porcine circovirus type 2 (PCV 2) with the real-time PCR were developed. TaqMan probe real-time using a set of primer/probe was developed for detection of PCV 2. In this study we applied real-time PCR assay to 320 samples, collected from pig farms. In 151 of 320 samples, PCV 2 DNA was detected by conventional PCR assay. All samples positive for PCV 2 DNA in conventional PCR assay were also positive in Real-time PCR assay, but 69 of 169 samples that tested negative for PCV 2 DNA in conventional assay were tested positive in TaqMan probe real-time PCR assay. The test of TaqMan probe real-time PCR resulted in detection and quantification limits of 101 copies per sample. TaqMan probe real-time PCR assay increased the number of samples in which PCV 2 was detected by 21%. TaqMan probe real-time PCR assay is very efficient method in contrast to the conventinal PCR, becoming increasingly important method for gene analysis.

• 한국버섯학회지
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• 제1권1호
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• pp.28-33
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• 2003

느타리 세균성갈색무늬병 병원균 P. tolaasii의 전염원을 파악하기 위하여 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물로부터 PCR방법을 이용하여 병원세균을 검출한 결과, 주로 충북지방의 느타리 재배사에서 수집된 57개 물 시료 전체의 28.1%인 16개 물에는 $m{\ell}$당 1.000 cfu 이하의 일반 세균을 포함하고 있었으며 54.4%인 31개의 시료가 1,001-10,000 cfu, 10.5%인 6개의 시료가 10,001-100,000 cfu, 그리고 7%인 4개의 시료가 100,001 cfu 이상의 세균을 포함하고 있었다. P. tolaasii의 경우 nested-PCR로 검출하였을 경우 전체의 5.3%인 3곳의 물이 Immunocapture-nested-PCR로 검출하였을 경우 전체의 35.1%인 20개의 물 시료로부터 P. tolaasii 특이적 DNA가 증폭되었다. 물에 포함된 일반세균의 농도와 P. tolaasii 검출과는 상관없었다. 이상의 결과는 물로부터 병원균을 검출하는 방법으로 IC-nested-PCR 방법이 더 민감하고 우수한 방법이며 여러 곳의 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물이 병원균 P. tolaasii으로 오염되어 있는 것을 제시하고 있다.

• 식물병연구
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• 제10권1호
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• pp.53-57
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• 2004

CGMMV는 한국에서 수박의 주요 병원균이고, 수박 생산에 심각한 영향을 미친다. 이 연구에서는 박 종자의 CGMMV를 RT-PCR을 이용하여 신속하고 민감하게 검정하는 진단방법을 개발하였다. CGMMV-W의 외피 단백질 유전자 sequence에서 제작된 CGMMV에 특이적인 primer인 Wmfl과 Wmrl은 RT-PCR에 의해 420 bp의 증폭산물을 증폭하였다. RT-PCR에 의한 진단을 위하여 바이러스 추출과정을 간소화하고 종자 추출물의 반응 억제물질을 감소시키기 위해 ethanol 침전, double filtration, PEG 침전, phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 추출법을 비교하였으며 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의 한 추출법이 민감성이 강한 방법으로 선발되었다. RT-PCR을 위해 선발된 primer들과 추출법은 1,000립의 건전 종자에 1립의 이병 종자를 혼합한 수준까지 판별이 가능하였다. 신속하고 민감한 RT-PCR에 의한 본 검정방법은 높은 반응 억제물질을 함유하는 박 종자에서 CGMMV의 특이적인 진단을 위해 유용한 방법이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권7호
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• pp.1004-1007
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• 2014

Culture is the gold standard for diagnosis of tuberculosis, but it takes 6 to 8 weeks to confirm the result. This issue is complemented by the detection method using polymerase chain reaction, which is now widely used in a routine microbiology laboratory. In this study, we evaluated the performance of the Seegene Anyplex TB PCR to assess its diagnostic sensitivity and specificity, and compared its results with the Roche Cobas TaqMan MTB PCR, one of the most widely used assays in the world. Five university hospitals located in the Chungcheong area in South Korea participated in the study. A total of 1,167 respiratory specimens ordered for acid-fast bacilli staining and culture were collected for four months, analyzed via the Seegene Anyplex TB PCR, and its results were compared with the Roche Cobas TaqMan MTB PCR. For detection of Mycobacterium tuberculosis, the diagnostic sensitivity and specificity of the Anyplex TB PCR were 87.5% and 98.2% respectively, whereas those of the Cobas TaqMan were 92.0% and 98.0% respectively (p value > 0.05). For smear-positive specimens, the sensitivity of the Anyplex TB PCR was 95.2%, which was exactly the same as that of the Cobas TaqMan. For smear-negative specimens, the sensitivity of the Anyplex TB PCR was 69.2%, whereas that of the Cobas TaqMan TB PCR was 84.6%. For detection of MTB, the Seegene Anyplex TB PCR showed excellent diagnostic performance, and high sensitivity and specificity, which were comparable to the Roche Cobas TaqMan MTB PCR. In conclusion, the Anyplex TB PCR can be a useful diagnostic tool for the early detection of tuberculosis in clinical laboratories.

• 농업과학연구
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• 제42권2호
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• pp.99-103
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• 2015

Potato virus T (PVT) is a plant pathogen in the family Betaflexiviridae, group IV single-stranded positive sense RNA viruses. The major host of PVT is potato, and it has been reported in Ullucus tuberosus, Oxalis tuberosa and Tropaeolum tuberosum. This study aimed at developing reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR) and nested PCR techniques for specific detection of PVT. Finally, Two RT-PCR primer sets were developed and verified. The RT-PCR products were amplified to 734 (PVT RT-PCR primer set 6) and 828 bp (PVT RT-PCR primer set 29) long to detect PVT. The nested PCR primer sets [PVT-N70/C20 ($734{\rightarrow}315bp$) and PVT-N75/C30 ($828{\rightarrow}529bp$)] were developed which are high sensitivity and verification for detection of PVT. Furthermore, a modified-positive control plasmid is use to verify contamination of laboratory in PVT detection. This study supported the diagnose PVT in potato or PVT related hosts.