• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제38권1호
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• pp.1-5
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• 2011

The maturation process of mammalian oocytes accompanies an extensive rearrangement of the cytoskeleton and associated proteins. As this process requires a delicate interplay between the cytoskeleton and its regulators, it is often targeted by various external and internal adversaries that affect the congression and/or segregation of chromosomes. Asymmetric cell division in oocytes also requires specific regulators of the cytoskeleton, including formin-2 and small GTPases. Recent literature providing clues regarding how actin filaments and microtubules interact during spindle migration in mouse oocytes are highlighted in this review.

• 한국수산과학회지
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• 제48권4호
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• pp.483-488
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• 2015

We studied oocyte steroidogenesis in the blackfin flounder Glyptocephalus stelleri as a region-specific species, in the East Sea of Korea during the spawning season. Maturing oocytes (0.76, 0.82, 0.88, and 0.91 mm in oocyte diameter) were incubated in vitro in the presence of [$^3H$] $17{\alpha}$-hydroxyprogesterone ($[^3H]17{\alpha}$-OHP) as a precursor. Steroid metabolites were extracted from the incubated medium and oocytes, and the extracts were separated and identified by thin-layer chromatography (TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatographymass spectrometry (GC/MS). The major metabolites produced from $[^3H]17{\alpha}$-OHP were androgens [androstenedione (A4) and testosterone (T)] and estrogens [$17{\beta}$-estradiol (E2) and estrone (E1)] and progestins [$17{\alpha},20{\alpha}$-dihydroxy-4-pregen-3-one ($17{\alpha}20{\alpha}P$) and $17{\alpha}20{\beta}$-dihydroxy-4-pregnen-3-one ($17{\alpha}20{\beta}P$)] in maturing oocytes. The metabolic rate of $17{\alpha}20{\beta}$ was elevated (29.04%) in oocytes measuring 0.88 mm (nucleus migration stage following the induction of germinal vesicle breakdown), but was very low in oocytes measuring 0.76, 0.82, and 0.91 mm (0.42, 0.67, and 2.62%, respectively). From these results, we suggest that $17{\alpha}20{\beta}P$ acts as a maturation-inducing steroid in the blackfin flounder.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제13권3호
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• pp.145-153
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• 2009

Previously, we obtained the list of genes differentially expressed between GV and MII oocytes. Out of the list, we focused on functional analysis of Zap70 in the present study, because it has been known to be expressed only in immune cells. This is the first report about the expression and its function of Zap70 in the oocytes. Synthetic 475 bp Zap70 dsRNA was microinjected into the GV oocytes, and the oocytes were cultured in vitro. In addition to maturation rates, meiotic spindle and chromosome rearrangements, and changes in expression levels of transcripts of three kinases, Erk1/2, JNK, and p38, were determined. Zap70 is highly expressed in immature GV oocytes, and gradually decreased as oocyte matured. When dsRNA of Zap70 was injected into the GV oocytes, Zap70 mRNA specifically and completely decreased by 2 hr and its protein expression also decreased significantly. Absence of Zap70 resulted in maturation inhibition at meiosis I (57%) with abnormalities in meiotic spindle formation and chromosome rearrangement. Concurrently, mRNA expression of Erk2, JNK, and p38, were affected by Zap70 RNAi. Therefore, we concluded that Zap70 is involved in MI-MII transition by affecting expression of MAP kinases.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제30권4호
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• pp.299-307
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• 2003

Objectives: The present study was conducted to evaluate the mobile transposon-like element, clone MTi7 (MTi7) expression in the mouse ovary and to determine its role(s) in the mouse oocytes by RNA interference (RNAi). Methods: MTi7 mRNA expression was localized by in situ hybridization in day5 and adult ovaries. Double stranded RNA (dsRNA) was prepared for c-mos, a gene with known function as control, and the MTi7. Each dsRNA was microinjected into the germinal vesicle (GV) stage oocytes then oocyte maturation and intracellular changes were evaluated. Results: In situ hybridization analysis revealed that MTi7 mRNA localized to the oocyte cytoplasm from primordial to preovulatory follicles. After dsRNA injection, we found 43-54% GV arrest of microinjected GV oocytes with 68%-90% decrease in targeted c-mos or MTi7 mRNA. Conclusions: This is the first report of the oocyte-specific expression of the MTi7 mRNA. From results of RNAi for MTi7, we concluded that the MTi7 is involved in the germinal vesicle breakdown in GV oocytes, and MTi7 may be implicated with c-mos for its function. We report here that RNAi provides an outstanding approach to study the function of a gene with unknown functions.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제38권2호
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• pp.68-74
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• 2011

Objective: Previously, we found that oocyte specific homeobox (Obox) 4 plays significant role in completion of meiosis specifically at meiosis I-meiosis II (MI-MII) transition. The purpose of this study was to determine the mechanism of action of $Obox4$ in oocyte maturation by evaluating downstream signal networking. Methods: The $Obox4$ dsRNA was prepared by $in$ $vitro$ transcription and microinjected into the cytoplasm of germinal vesicle oocytes followed by $in$ $vitro$ maturation in the presence or absence of 0.2 mM 3-isobutyl-1-metyl-xanthine. Total RNA was extracted from 200 oocytes of each group using a PicoPure RNA isolation kit then amplified two-rounds. The probe hybridization and data analysis were used by Affymetrix Gene-Chip$^{(R)}$ Mouse Genome 430 2.0 array and GenPlex 3.0 (ISTECH, Korea) software, respectively. Results: Total 424 genes were up (n=80) and down (n=344) regulated after $Obox4$ RNA interference (RNAi). Genes mainly related to metabolic pathways and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway was changed. Among the protein kinase C (PKC) isoforms, PKC-alpha, beta, gamma were down-regulated and especially the MAPK signaling pathway PKC-gamma was dramatically decreased by $Obox4$ RNAi. In the cell cycle pathway, we evaluated the expression of genes involved in regulation of chromosome separation, and found that these genes were down-regulated. It may cause the aberrant chromosome segregation during MI-MII transition. Conclusion: From the results of this study, it is concluded that $Obox4$ is important upstream regulator of the PKC and anaphase-promoting complex action for maintaining intact germinal vesicle.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제34권2호
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• pp.95-106
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• 2007

목 적: 본 연구진은 선행연구를 통하여 생쥐의 미성숙 난자와 성숙 난자 사이에 차이 나게 발현하는 유전자(DEGs)의 목록을 보유하고 있는데, 그 중에서 pentose phosphate pathway (PPP)에 필수적 효소인 Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia)를 선택하여 본 연구를 수행하였다. 난자 성숙 과정에 관련된 Rpia의 기능을 알아보기 위한 기초연구로서 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia의 발현을 비교분석 하였다. 연구방법: 생쥐의 각 조직에서 11개의 MII-selective DEGs의 발현을 RT-PCR방법으로 확인하여 난소에서 강하게 발현하는 4개의 유전자를 선택하였고, 다시 이들 4개 유전자 중 난자에서 높게 발현하는 Rpia를 선택하여 생쥐 및 돼지의 난자, 난구세포, 과립세포에서의 발현을 비교분석 하였다. 돼지 Rpia 염기서열은 밝혀져 있지 않아 EST clustering 기법을 통해 동정하였다. 결 과: EST clustering 기법으로 찾아낸 돼지 Rpia 염기서열은 GenBank에 등록하였고 (Accession Number EF213106), 이를 근거로 primer를 작성하여 RT-PCR을 수행하였다. Rpia 유전자는 생쥐에서는 난자 특이적으로 발현하는 반면 돼지에서는 난자, 난구세포, 과립세포에서 모두 발현하는 차이점을 발견하였다. 결 론: 본 연구는 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia유전자 동정에 대한 첫 보고로서, 본 연구결과로부터 생쥐와 돼지의 COCs는 서로 다른 경로로 포도당의 대사가 일어나는 것을 알 수 있었다. 따라서 이와 같은 차이점이 두 종의 난자를 체외 배양할 때 나타나는 난자 성숙률의 차이를 가져오는 기전 중의 하나가 아닐까 추측된다. 난자 성숙을 조절하는 기전을 연구함과 동시에 체외에서 난자 성숙이 어려운 종의 최적의 IVM (in vitro maturation)조건을 찾기 위해서는 앞으로 난자와 주변세포의 포도당 대사과정에 미치는 Rpia의 기능에 대한 후속연구가 필요할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제16권4호
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• pp.289-299
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• 1993

돼지 난포내의 각 구성분들에 대해 10% SDS-PAGE와 IEF를 이용한 이차원 전기영동을 실시하여 세포 및 난포액 구성분의 구조단백질상을 분석하였다. 난자-난구세포 복합체를 호르몬과 15%의 FCS가 포함된 M16 배양액으로 39$^{\circ}C$, 5% CO2 상태에서 35시간 동안 체외배양하였다. 배양 전후의 난자, 투명대 및 난구세포와 난포 크기별로 회수된 난포액들을 각각 분리 회수하여 구조단백질상을 분석하였으며, Silver 염색과 CBB 염색으로 분석이 가능한 각 구성분의 적정 시료량을 조사하였다. 한편 난포 구성분들에 있어서 난자는 분자량이 25와 114kd, 난구세포는 20, 33, 58, 78 및 112kd, 투명대는 65kd, 그리고 난포액은 18, 76, 92, 152 및 187kd 단백질을 세포특이단백질로 가지고 있음이 확인되었다. 특히 난자의 경우 성숙에 따라 구조단백질상의 변화가 확인된 반면, 난구세포에서는 차이가 없었다. 또한 난포액은 난포의 크기에 따라서는 단백질상의 차이가 없었으나 호르몬 처리 여부에 따라서는 이차원 전기영동상에서 몇가지 단백질에서 차이가 확인되었고, 난포세포들도 폐쇄 여부에 따라 단백질 조성에 차이를 보였다. 따라서 본 실험에서는 전기영동에 필요한 시료의 양과 준비 방법을 확립하여 각 난포 구성분들의 단백질상 분석에 대한 기초자료를 확립하였으며, 이상의 결과는 앞으로 진행될 단백질의 생합성 분석이나 면역화학학적 분석에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권3호
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• pp.187-197
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• 2009

목 적: 단백질 인산화는 세포신호전달에 매우 중요한 현상으로서, 수많은 조절인자들이 난자성숙에 관여하게 된다. 그러나 이들 중에서 어떤 단백질이 인산화되어 난자성숙을 조절하는지는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 체세포의 신호전달과정에서 인산화를 통해 중요한 기능을 한다고 알려져 있는 일곱 가지 단백질들이 생쥐의 난자성숙과정에서 어떻게 인산화 되고 있는지 알아보고자 한 개 샘플에서 일곱 개의 변화를 한꺼번에 측정할 수 있는 bead-based multiplex phosphorylation assay를 이용하여 본 연구를 수행하였다. 연구방법: ICR 생쥐에 PMSG를 주사하고 46시간 후에 cumulus-oocyte complex (COCs) 형태로 미성숙 난자를 채취한 후 체외배양 하면서, 배양 2시간 후에 GVBD를, 배양 8시간 후에 MI을, 배양 16시간 후에 MII 단계의 난자를 얻었고 체내에서 배란한 MII 단계의 난자는 수란관에서 얻었다. 각 단계의 난자를 100개씩 모아서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)에 속하는 세가지 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 Akt, GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kapa}B{\alpha}$, STAT3 등 총 일곱 단백질의 인산화를 Bio-Plex System을 이용하여 같은 시료에서 동시에 측정하였으며 세 번의 반복실험을 통하여 얻어진 결과를 통계적으로 분석하였다. 결 과: 생쥐의 난자성숙과정에서 측정된 일곱 가지 단백질 중에서 인산화가 현저히 증가하는 단백질로는 ERK1/2, JNK, p38 MAPK와 STAT3로서 미성숙 난자에 비해서 3배에서 20배까지 인산화되는 결과를 보였다. 반면에 GSK-$3{\alpha}/{\beta}$, $I{\kappa}B{\alpha}$의 인산화의 변화는 미약하였으며, Akt의 경우에는 변화가 전혀 없었다. 난자성숙 과정에서 분석 대상 단백질들의 인산화는 GVBD 단계에서 활성화되기 시작하여 MI에서 현저히 높게 증가하며 MII까지 높게 유지되었다. 결 론: 본 연구는 난자성숙과정에서 일곱 가지 단백질의 인산화를 동시에 측정한 최초의 보고로서 이 방법은 난자와 같이 적은 양의 시료에서의 여러 개의 단백질 인산화를 동시에 분석하는데 유용할 것으로 생각된다. 본 연구결과, 세 가지 MAPK 단백질인 ERK1/2, JNK, p38 MAPK 외에도 STAT3가 난자성숙에 있어서 매우 중요한 조절자로 생각되었다. 또한 Akt의 473번 serine기의 인산화는 난자성숙에 관여하지 않음을 알 수 있었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제8권1호
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• pp.35-42
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• 2004

미성숙의 Germinal Vesicle(GV 단계에서 성숙한 Metaphase II(MII) 단계가 되는 난자성숙 과정은 핵과 세포질의 성숙을 통해 이루어지며, 이를 통해 수정과 배 발달을 할 수 있는 능력을 갖게 된다. GV 난자는 prophase I 단계에 arrest 되어 있다가 meiosis 과정을 거쳐 성숙한 MII로 되는데 이를 조절하는 기작에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 미성숙 난자와 성숙 난자간의 유전자 발현의 차이를 동정함으로써 난자성숙에 관여하는 유전인자를 밝히고자 하였다. GV와 MII 난자에서 mRNA를 정제한 후 ACP System을 이용하여 두 그룹간의 유전자 발현 차이를 분석하여 양적으로 서로 다르게 발현하거나 한쪽에서만 특이적으로 발현하는 유전자를 cloning하여 Sequencing과 BLAST search를 통해 분석하였다. ACP 1번부터 20번까지를 사용하여 32개의 유전자를 찾았으며 이중 26개가 기능적으로 알려진 유전자였다. Pscd2를 포함한 4개의 유전자는 GV에 특이적으로 발현하였고, PKD2와 CSN3를 포함하는 10개의 유전자는 GV에서 더 높게 발현하였으며 Diva를 포함하는 12개의 유전자는 MII에서 더 높게 발현하였다. 본 연구를 통해 분석된 모든 유전자는 난자에서의 발현은 보고되지 않은 것으로 ACP System을 통해 최초로 동정되었으며 특히 PKD-CSN Signaling pathway가 난자에서 발현함을 알 수 있었다. 본 연구는 난자 성숙 과정에서 서로 다르게 발현하는 유전인자를 성공적으로 동정하였으며 향후 이들의 기능을 연구함으로써 난자성숙 조절기전을 연구하는데 기여할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.113-113
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• 2002

The stimulatory effect of EGF and FSH on oocyte maturation have been reported in various mammalian species. And some reports presented FSH enhanced the effect of EGF on oocyte maturation. But, the interaction between EGF and FSH on nuclear maturation of mammalian oocytes is not fully understood. We observed the effect of EGF and FSH on nuclear maturation during in vitro maturation of mouse oocytes. Also, we examined the interaction between EGF and FSH on nuclear maturation of mouse oocytes using the EGFR inhibitor or FSH inhibitor. Germinal vesicle (GV) stage oocytes were obtained from 3-4weeks PMSG primed BCFI hybrid mice and cultured in TCM-199 medium with 0.4%PVP supplemented with/without EGF (1ng/ml), FSH (1ug/ml), EGFR specific tyrosine kinase inhibitors: Tyrphostin AG 1478 (500nM), MAP kinase kinase inhibitor : U0126 (20uM) or PD 98059 (100uM) for 14-l5hr. Rapid staining method were used for the assessment of nuclear maturation. Nuclear maturation rates of EGF indjor FSH-treated group were significantly higher than those of control group. Treatment of EGFR inhibitor significantly block the nuclear maturation of GV oocyte in EGF-treated group, but it did not block those of GV oocyte in FSH-treated or FSH and EGF-treated group. Treatment of FSH inhibitor(U0126, PD98059) significantly block the nuclear maturation of EGF-treated group, FSH-treated and FSH and EGF-treated group. These results show that EGF has a stimulatory effect as well as different action pathway with FSH on in-vitro maturation of mouse oocyte in vitro. Therefore, further studies will be needed to find the signaling pathway of EGF associated with nuclear maturation.