Metallo-${\beta}$-lactamase (MBL) can hydrolyze all ${\beta}$-lactams except monobactams and frequently coexists with various antibiotic resistance genes such as aminoglycoside resistance, sulfonamide resistance gene, etc. Therefore, the effective antibiotics against infections by these bacteria are markedly limited or can't even be found. We tried to search in-vitro antimicrobial combinations with synergistic effects for a VIM-2 type MBL producing Pseudomonas aeruginosa, isolated from clinical specimen. On the selection of antibiotic combinations with synergistic effects, we performed a one disk synergy test, modified Pestel's method, in agar without aztreonam (AZT). The bacteriostatic synergistic effects of this tests were scored as $S_1$ (by susceptibility pattern in agar without antibiotics), $S_2$ (by the change of susceptibility in agar with or without antibiotics) and $S_3$ ($S_1$ + $S_2$) and was classified into weak (1 point), moderate (2 points) and strong (3 points) by $S_3$ score. Subsequently, we carried out the time-killing curve for the antibiotic combinations with the strong synergistic bacteriostatic effect. One VIM-2 type MBL producing P. aeruginosa confirmed by the PCR showed all resistance against all ${\beta}$-lactams except AZT, aminoglycoside and ciprofloxacin. In the one disk synergy test, this isolate showed a strong bacteriostatic synergistic effect for the antibiotic combination of AZT and piperacillin-tazobactam (PIP-TZP) or AZT and amikacin (AN). On the time-killing curve after six hours of incubation, the colony forming units (CFUs/mL) of this bacteria in the medium broth with both combination antibiotics were decreased to 1/18.7, 1/17.1 of the least CFUs of each single antibiotics. The triple antibiotic combination therapy including AZT, PIP-TZP and AN was shown to be significantly synergistic after 8 hrs of exposure. In a VIM-2 MBL producing P. aeruginosa with susceptibility for AZT, the triple antibiotic combination therapy including AZT, PIP-TZP and AN may be considered as an alternative antibiotics modality against the infection by some MBL type. But the antimicrobial combination therapy for many more MBL producing isolates is essential to know as soon as possible for the selection of effective treatment against the infection by this bacteria.
국내 대학병원에서 분리되어 imipenem 에 대한 최소억제농도가 $8{\mu}g/ml$ 이상인 51개의 포도당비발효 그람음성 간균들 중 metallo-${\beta}$-lactamase (MBL)을 생성하는 균주들을 분리하고, 그들 중에서 내성이 강한 Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균제 병합요법의 효과를 알아보기 위하여 상승효과를 보이는 항균제 조합을 찾아보았다. 9개의 균주(Pseudomonas aeruginosa 2주 및 Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans 7주)가 MBL 양성을 나타냈으며, PCR 결과 9주 모두에서 $bla_{VIM-2}$ 유전자가 관찰되었다. 이들 중에서 P. aeruginosa DK569는 aztreonam (MIC; $8{\mu}g/ml$)을 제외하고 실험한 모든 ${\beta}$-lactam 항균제, aminoglycoside, ciprofloxacin에 내성을 보여 aztreonam 함유 배지를 이용하여 상승효과률 보이는 항균제를 찾고자 하였다. One disk synergy test 에서 선별된 항균제 조합을 이용하여 생존률 검사 실험을 한 결과, aztreonam (AZT)와 piperacillin-tazobactam (TZP)의 병합은 항균제 노출 6시간 후에 AZT 또는 TZP의 단독 항균제 노출시 보다 균수가 1/18.7로 감소하였다. 그리고 AZT와 amikacin (AN)의 병합에서도 항균제 노출 6 시간 후에 AZT 또는 AN의 단독항균제의 투여보다 균수가 1/17.1 로 감소하였다. 결국 위 두 조합은 의미있는 상승효과를 보이지 못하여 위 세 항균제를 조합하여 실험하였다. 위의 세 항균제를 병합하였을 때 항균제 노출 8시간 후에 AZT, TZP 및 AN의 단독 투여에 비하여 병합요법에 의해 균수가 1/183.3 로 감소하여 의미있는 상승효과를 보였다. 이 결과는 치료가 쉽지 앓은 MBL 생성균에 의한 감염에 대한 치료에 AZT, TZP 및 AN의 세 가지 항균제 병합요법이 유용할 것이라는 것을 의미한다.
본 연구에서는 ESBL을 생성하는 Escherichia coli의 Extended-spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) 유전자와 퀴놀론 내성결정부위(qnr)의 유전자형과 항생제 내성 양상을 규명하고자 하였다. 임상검체에서 분리 된 E. coli 274개 균주를 대상으로 double-disk synergy test 검사를 실시하여 42개의 ESBL 생성 균주를 분리하였다. 검체별로는 소변에서 28균주가 분리되었으며, 객담에서 6균주, 농에서 3균주, 상처에서 2균주, 혈액에서 2균주 그리고 조직에서 1균주가 분리되었다. 이 균주들을 대상으로 ESBL 유전자와 퀴놀론 내성 유전자를 PCR을 이용하여 검색하였다. 35개의 균주가 1개 혹은 2개의 ESBL 유전자를 보유하고 있었다. ESBL 유전자의 분포는 CTX-M-1이 가장 많았으며, CTX-M-9과 TEM 유전자 순이었다. SHV, CTX-M-2와 CTX-M-8는 검출되지 않았다. qnr 유전자는 10개 균주에서 검출되었으며 유전형별로는 qnrB4, qnrB1, qnrS 1 순이었다. 2가지 이상의 ESBL 유전자를 동시에 보유한 균주와 ESBL과 qnr 유전자를 동시에 보유한 균주가 검출되었다. ESBL 유전자 보유균주는 cefotaxmie (80.0%), levofloxacin (82.9%)과 ampicillin (100%)에 고도내성을 보였다. qnr 유전자 보유 균주의 cefotaxmie, levofloxacin과 ampicillin에 대한 내성율은 각각 70%, 70%, 100%였다. ESBL 유전자들간의 그리고 qnr 유전자와의 동시 보유가 항생제 내성에 미치는 상승효과는 없었다. qnr 유전자 보유와 퀴놀론에 대한 내성 사이의 상관관계도 없었다.
Carbapenem is recently considered as the last resort of the therapeutics for gram negative bacterial infection. Increasing of organisms producing metallo-β-lactamase (MBL), we have difficulty in choosing the antimicrobial agents. Among 345 clinical isolates of Pseudomonas spp., 61 isolates (17.7%) were positive for the modified imipenem or meropenem-Hodge test and 55 isolates (15.9%) were positive for the imipenem-EDTA + SMA double disk synergy test (DDS). PCR and sequencing of blaVIM-2-allele and blaIMP-1-allele showed that 17 isolates of Pseudomonas aeruginosa, 9 isolates of Pseudomonas taiwnensis and 2 Pseudomonas plecoglossicida had blaVIM-2, and 22 isolates of P. aeruginosa and one Pseudomonas otitidis had blaIMP-6. These MBL genes were all in class 1 integron. The size of class 1 integron with blaVIM-2 ranged from 3.5 kb to 5.5 kb in clinical isolates of Pseudomonas spp. including P. aeruginosa. blaVIM-2 was most often located first in the class 1 integron, sometimes in the second or third position, and these integrons often had aacA4 or aadA1. Strict infection control measures are needed to more effectively prevent further spread of these MBL-producing Pseudomonas spp. In addition, MBL-producing Pseudomonas spp. is expected to continue to spread in various countries and regions.
Among 53 Acinetobacter baumannii isolates collected in 2004, nine imipenem-resistant isolates were obtained from clinical specimens taken from patients hospitalized in Busan, Korea. Nine carbapenemase-producing isolates were further investigated in order to determine the mechanisms underlying resistance. These isolates were then analyzed via antibiotic susceptibility testing, microbiological tests of carbapenemase activity, pI determination, transconjugation test, enterobacterial repetitive consensus (ERIC)-PCR, and DNA sequencing. One outbreak involved seven cases of infection by A. baumannii producing OXA-23 ${\beta}-lactamase$, and was found to have been caused by a single ERIC-PCR clone. During the study period, the other outbreak involved two cases of infection by A. baumannii producing IMP-1 ${\beta}-lactamase$. The two clones, one from each of the outbreaks, were characterized via a modified cloverleaf synergy test and an EDTA-disk synergy test. The isoelectric focusing of the crude bacterial extracts detected nitrocefin-positive bands with pI values of 6.65 (OXA-23) and 9.0 (IMP-1). The PCR amplification and characterization of the amplicons via direct sequencing showed that the clonal isolates harbored $bla_{IMP-1}$ or $bla_{oxA-23}$ determinants. The two clones were characterized by a multidrug resistance phenotype that remained unaltered throughout the outbreak. This resistance encompassed penicillins, extended-spectrum cephalosporins, carbapenems, monobactams, and aminoglycosides. These results appear to show that the imipenem resistance observed among nine Korean A. baumannii isolates could be attributed to the spread of an IMP-lor OXA-23-producing clone. Our microbiological test of carbapenemase activity is a simple method for the screening of clinical isolates producing class D carbapenemase and/or class B $metallo-{\beta}-lactamase$, in order both to determine their clinical impact and to prevent further spread.
Kim Yun-Tae;Oh Kwang-Seok;Choi Seok-Cheol;Kim Tae-Un
대한의생명과학회지
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제11권3호
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pp.389-396
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2005
Resent studies have reported increased isolation of extended-spectrum $\beta-lactamase$ (ESBL) producing strains at several hospital in Korea. We studied to investigate the isolation rates of ESBL strains from clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and to characterize differences in types using analyses of genotyping and antibiotic susceptibility test. Antibiotic susceptibility test with confirmation of ESBL by double disk synergy test was performed on the 54 ESBL strains of Klebsiella pneumoniae from a hospital in Busan. Transfer of resistant gene in ESBL strains resistant to 3rd generated antibiotics was confirmed by transconjugation test using E. coli $RG176^{nal(r)}$. blaTEM, blaSHV, blaCTX-M genes were detected by PCR. ESBL producing strains had 100% of resistant rate to ampicillin, azteronam, cefazolin, cefepime and ceftriaxone ($\beta-lactam$ antibiotics). Forty strains of bla TEM$(74\%)$, 41 strains of bla SHV $(76\%)$, 23 strains of bla CTX-M $(43\%)$ were found, respectively. The strains had one or more genes. They had high resistant rates to $\beta-lactam$ antibiotics including cephalosporin. The resistant rates of strains with multiple resistant genes were higher than those of strains with single resistant gene.
This study was conducted to investigate the prevalence and genotypes of extended-spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) in 377 Escherichia coli isolated from healthy and sick animals. Two isolates (0.5%), each of which were isolated from diseased swine and chicken, respectively, were confirmed as ESBL producing isolates by double disk synergy test, and showed a multidrug resistant phenotype. Minimum inhibitory concentration of cefotaxime for the two ESBL producing isolates were 3~4 times higher than those of ceftazidime, respectively. By PCR and sequencing, one isolate from swine have both $bla_{CTX-15}$ and $bla_{TEM-1}$, and one isolate from chicken have $bla_{CTX-15}$ and $bla_{TEM-116}$. Also, these genes were transferred to E. coli J53 by conjugation. These two isolates showed unrelated pulsed-field gel electrophoresis. To our knowledge, this is the first time that $bla_{TEM-116}$ gene was identified in E. coli isolated from animals in Korea. These results suggest more prudent use of third- generation cephalosporins, and surveillance and monitoring for ESBL producing E. coli in both animals and their environments should be necessary.
최근 extended-spectrum $\beta-lactamase$ 생산 임상 균주의 급속한 증가와 확산은 매우 심각한 문제를 야기하고 있다. 이에 국내에서 extended-spectrum $\beta-lactamase$ 생산 임상 균주의 발생율을 파악하고자 국내 한 대학병원에 입원한 환자로부터 대장균을 분리하여 항생제 감수성 검사를 실시하였다. 충 233균주 중 184균주 $(78.9\%)$가 ampicillin에 대해 내성을 나타냈으며, 80균주$(34.3\%)$가 cephalothin에, 93균주$(39.9\%)$가 gentamicin에, 64균주$(27.5\%)$가 norfloxacin에 대해 내성을 나타내었다. 이중 17균주$(7.3\%)$가 double disk synergy test에 의해 양성반응을 나타낸 것으로 확인되었고, 이들에 대해서 6가지 항생제에 대한 최소 억제 농도를 추가적으로 시험한 결과, 13 균주가 4가지 이상의 다른 계열의 항생제에 대한 다중 약제 내성인 것으로 나타났다. Isoelectric focusing gel electrophoresis에 의한 pI값과 DNA 염기서열을 분석한 결과 5균주가 TEM-1,1균주가 TEM-15,1 균주가 TEM-20,4균주가 TEM-52,2균주가 TEM-1과 AmpC, 1균주가 TEM-1과 OXA-30,1 균주가 TEM-1과 OXA-33,1 균주가 TEM-1, CTX-M-3, AmpC, 그리 고 1 균주가 AmpC를 생산하는 것으로 나타났으며, SHV를 생산하는 균주는 없었다. 이들의 항생제내성 유전자가 전달되는지 확인한 결과 동물로부터 분리된 대장균 (CCARM No.1203)에 extended-spectrum $\beta-lactamase$생산 유전자가 전달되는 것을 확인하였다. Random amplified polymorphic DNA와 pulsed field gel electrophoresis분석을 사용하여 genomic DNA에 대한 유전형을 분석한 결과 균주간의 유전적 연관성은 매우 낮은 것으로 나타나 한 병원에서 발견되는 균주는 clonal spread에 의한 것이라는 일반적인 보고와 다른 결과를 얻었다.
Extended-spectrum ${\beta}$-lactamases(ESBL)은 penicillin과 cephalosporin뿐 아니라 oxyimino-${\beta}$-lactam 제재도 내성을 가지며 Klebsiella pneumoniae와 Escherichia coli의 ESBL 생성율은 전세계적으로 증가하고 있다. 내성율은 ${\beta}$-lactam제의 사용량에 영향을 받으므로 시기, 지역, 병원, 병동 등에 따라서 차이가 있을 수 있어 각 병원에서 발생하는 내성균주를 수시로 파악할 필요가 있다. 이에 저자들은 영남대학교 의과대학 부속병원 미생물 검사실에서 동정된 K. pneumoniae와 E. coli를 대상으로 ESBL 생성율을 구하고 이들 환자의 정보를 분석하여 병원 감염관리와 감염환자의 치료에 지침을 마련하고자 하였다. 실험에 사용된 K. pneumoniae의 51.6%, E. coli의 16.0%에서 ESBL생성 양성을 보였다. 대부분의 ESBL생성 양성 균주는 중환자실과 여기를 거쳐간 환자를 중심으로 동정되어 이들에 대한 치료와 내성균주 전파에 특별한 주의를 요하며 계속적인 변동상황에 주의를 기울여야 할 것으로 생각된다.
Chromosomal 인 SHV-11 $\beta$-lactamase가 plasmid를 매개로 다른 균주로 전달 되는 현상은 흔하지 않다. 본 연구에서는 플라스미드성 SHV-11 $\beta$-lactamase를 동시에 가지고 있는 ESBL생성 두 균주를 검출하였다. 따라서 이들 균주에 대한 유전적 특성과 임상적 의의에 대해 알아보고자 하였다. Vitek system과 이중디스크확산법을 이용하여 ESBL생성균주를 검출하였고, PCR과 DNA 염기서열분석을 이용하여 SHV-11 $\beta$-lactamase를 가지고 있는 ESBL생성균주를 확인 하였다. 이들 균주를 교차접합실험과 형질전환실험을 이용하여 유전자전이를 확인하고 액체배지 희석법으로 3세대 cephalosphorin 항생제에 대한 최소억제농도를 측정하였다. 이들 균주의 유전형 분석결과는 SHV-11 $\beta$-lactamase 유전자와 CTX-M-15 ESBL 유전자를 동시에 가지고 있었다. 3세대 cephalosphorin 항생제에 대한 최소억제농도는 SHV-11 $\beta$-lactamase와 CTX-M-15 ESBL 유전자를 동시에 가지고 있는 균주에서 $64{\mu}g/ml$ 이상이었고, SHV-11 $\beta$-lactamase 만을 가지고 재조합 한 균주에서 $0.5{\mu}g/ml$ 이하로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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