Growth hormone (GH) transgenesis in fish has the potential to improve aquaculture efficiency and capacity. However, many fast-growing transgenic fish have experienced side effects caused by excess GH expression. To overcome this unwanted issue associated with several GH transgenic mud loach Misgurnus mizolepis lines carrying GH construct driven by a strong ${\beta}$-actin regulator ($pml{\beta}$-actGH), we performed an alternative version of GH autotransgenesis using a weaker but more stable regulator, the mud loach lectin promoter. GH transgenesis with a pmlectGH construct consisting of the mud loach GH gene driven by the 2.3-kb lectin promoter exhibited significant growth stimulation. However, the extent of the growth acceleration in pmlectGH transgenics (six times maximum when assessed 2 months post hatching) was much less than that in transgenic individuals carrying the $pml{\beta}$-actGH construct. Additionally, the extraordinary gigantism that was common in $pml{\beta}$-actGH-transgenic mud loaches was diminished in transgenic loaches harboring the pmlectGH construct. Transgenic founders (pmlectGH) successfully transmitted their transgene into the next generation with up to 41% frequency. Growth stimulation also persisted in the transgenic F1 strains, with a seven-fold increase in maximum body weight at 6 months of age.
미꾸라지를 대상으로 어류 유전자 이식을 위한 유용 model system으로 개발하기 위한 연구의 일환으로 잉어의$\beta$-actin 유전자의 promoter와 CAT 유전자가 융합되어 있는 외래 유전자 (pFV4CAT)를 미꾸라지에 이식, transgenic founder 미꾸라지를 생산하였다. PCR 분석결과, 이식된 외래 유전자는 부화 후 9개월된 성어에서 7.4-37.0%의 빈도로 존재하였으며 Southern blot 분석에 의해서 염색체 상의 삽입 가능성을 나타내었다. In situ immunohistochemical analysis 결과 이식된 외래 유전자는 미꾸라지 세포내에서 비교적 높은 빈도로 발현하였으며 그 발현 양상은 개체마다 다양하게 나타났다.
1998년 3월부터 2000년 4월까지 전라남 북도 및 충청남도 일원의 내수면 양식장에서 사육중인 잉어(Cyprinus carpio)와 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)를 채집하여 아가미에서 3종의 단생흡충류를 검출하였다. 검출된 단생 흡충류는 잉어에서는 Dactylogyrus extensus(Mueller and Cleave,1932)와 Diplozoon niponicum(Goto, 1891)을, 미꾸리에서는 Gylodactylus paralatus(Gussev,1955)가 검출되었다. 이들 단생흡충 중 Dactylogyrus extensus와 Gylodactylus paralatus는 국내에서는 처음으로 보고되는 종이다.
본 연구는 병저항성 OsCK1 유전자와 제초제저항성 PAT 유전자가 도입된 병저항성 GM벼에서 도입 유전자의 발현 검증과 수서환경의 비표적 생물체인 잉어와 미꾸리에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행되었다. 병저항성 GM벼에 도입된 OsCK1와 PAT 유전자의 PCR 분석 결과, 병저항성 GM벼에서만 특이적인 밴드가 검출되었으며, PAT 단백질 발현량을 ELISA 분석한 결과, 병저항성 GM벼에서만 $45.44{\pm}2.23{\mu}g/g$ 수준으로 검출되었고, 모품종인 낙동벼에서는 검출되지 않았다. 병저항성 GM벼와 낙동벼의 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)와 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과, 48시간 및 96시간-$LC_{50}$ 은 5,000 mg/L 이상으로 나타났다. 48시간 및 96시간 무영향농도 NOEC)는 5,000 mg/L이었다. 급성독성 시험기간 중 병저항성 GM벼와 낙동벼간의 pH, DO, 수온, 체중 및 전장에 대한 유의적인 결과는 나타나지 않았다.
미꾸리 암컷과 미꾸라지 (Misgurnus mizolepis))$\times$미꾸리(M. anguillicaudatus) 잡종 수컷을 교배시켜 역교배체를 생산하였다. 역교배체의 수정율과 부화율은 친어 수컷으로 사용된 미꾸리와 유사하였다. 더욱이 역교배체는 난황흡수기에 저온에 저항성을 보여 전 실험군이 폐사한 미꾸리군에 비하여 단 14%의 낮은 초기 사망률을 나타내어 뚜렷한 생존율 증가가 관찰되었다. 역교배체의 적혈구 크기와 DNA 함량은 친어 암, 수의 중간을 나타내었고 역교배체는 2n=48 혹은 2n=49인 2가지 종류의 2배체 염색체수를 나타내었다. 부화후부터 6개월 동안 동일 조건에서 성장률을 조사한 결과, 역교배체는 친어 암, 수의 중간 성장을 보여 어류양식시 새로운 양식대상 어종으로의 가능성을 시사하였다. 역교배체는 거의 미꾸리와 체색 및 형태에서 유사하였으나 형질계측결과 친어 암수의 중간을 나타내는 형질 및 몇 개의 새로운 획득형질이 관찰되었다. 역교배체는 부화후 2개월 및 부화후 4개월에서 각기 성비를 조직학적으로 조사한 결과 암컷을 전혀 발견할 수 없어 전 수컷 단성집단 생산의 가능성을 보였다.
해충저항성 Bt벼와 낙동벼의 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)와 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과 48시간 및 96시간-LC50은 1,000mg/L 이상으로 나타났다. 48시간 및 96시간 무영향농도(NOEC)는 1,000mg/L이었다. 급성독성 시험기간 중 해충저항성 Bt벼와 낙동벼간의 pH, DO, 수온, 체중 및 전장에 대한 유의적인 결과는 나타나지 않았다.
The plasma proteins of fresh water fishes have been fractionated by disc electrophoresis in acrylamide gels utilized as an electrophoretic supporting medium. The species of fishes examined in this experiment were Anguilla japonica, Misgurnus mizolepis, Parasilurus asotus, Siniperca scherzeri, Pelteobagrus fulvidra, Carassius carassius, Cyprinus carpio, and Hemibarbus labeo, obtained in the Han River. Disc electrophoresis was performed as described by Ornstein and Davis. Gels and buffer solution were prepared by the method developed by W.J.Kim. The separation gels were 7% acrylamide gel. The fractionation of plasma proteins showed 13 bands in Anguilla japonica, 10 in Misgurnus mizolepis, 15 in Parasilurus asotus, 12 in Siniperca scherzeri, 11 in Pelteobagrus fulvidra, 13 in Carassius carassius, 9 in Cyprinus carpio, and 13 in Hemibarbus labeo. The patterns of plasma protein on the each species of fishes were different in the number of bands, ratio of contents, relative mobilities, and forms of fractionation.
EST analysis was performed to identify stress-responsive and immune-related genes from mud loach (Misgurnus mizolepis), cDNA libraries were constructed with liver, intestine and kidney tissues and randomly chosen clones (216 for liver, 198 for intestine and 224 for kidney) were subjected to automated sequence analysis. Of 638 clones sequenced in totlal, approximalely 25% of ESTs was novel sequences (no match to GenBank) or sequences with high homology to hypothrtical/unknown genes. Several potential stress-responsive biomarker and/or immure-related genes were identified in all the tissues examined. It included lectin, MHC class I/II proteins, proteinase inhibitors, superoxide dismulase, catalase, glutathionc-S. transferase, heat-shock protein, warm temperature acclimation protein, complements, methylrransferasc, zinc finger proteins, macrophage maturation associated protein, and others. This information will offer new possibilities as fundamental baseline data for the molecular genetics and breeding of this species with an emphasis on the development of stress. (and disease)-resistsnt fish.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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