• 제목/요약/키워드: MALDI- TOF

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CP4 EPSPS 검출을 위한 단클론 항체 생산 (Monoclonal antibody production for CP4 EPSPS detection assays)

  • 윤아미;김일룡;최원균
    • 환경생물
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    • 제39권4호
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    • pp.445-451
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    • 2021
  • Agrobacterium tumefaciens strain CP4 유래 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) 유전자를 포함하는 유전자변형생물체(Living modified organism, LMO)가 개발되었다. 이 같은 LMO는 국내 승인되어 사료용, 식품용, 가공용으로 이용 중이다. 간이면역 검사키트 개발을 위해서는 고효율의 단클론 항체 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 대장균 BL21 (DE3)에서 재조합 CP4 EPSPS 단백질을 정제하였으며 SDS-PAGE와 MALDI-TOF MS 분석으로 단백질 특성을 분석하였다. 단클론 항체 제작은 (주)앱클론의 SOP 매뉴얼에 따라 진행하였다. 본 연구 결과 5개의 단클론 항체 클론(2F2, 4B9, 6C11, 10A9, 10G9)를 확보하였다. 5종의 단클론 항체의 효율과 특이도 검정을 위해서 LM 면화 추출액을 이용한 western blotting 분석을 실시하였다. 모든 단클론 항체는 CP4 EPSPS를 함유하는 MON1445와 MON88913을 특이적으로 검출하였으며 비변형 면화 및 타종의 LM 면화에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과들을 바탕으로 CP4 EPSPS 단클론 항체는 LMO에 함유된 CP4 EPSPS 단백질을 타겟으로 항체 기반 검출법 개발에 활용될 것으로 사료된다.

Bacillus 속 분리주가 생산하는 박테리오신의 특성 조사 (Characterization of Bacteriocin Produced from Isolated Strain of Bacillus sp.)

  • 함승희;최낙식;문자영;백선화;이송민;강대욱
    • 생명과학회지
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    • 제27권2호
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    • pp.202-210
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    • 2017
  • 토하젓에서 분리한 박테리오신 생산 균주 중 상대적으로 넓은 항균스펙트럼을 나타내는 1균주를 선발하였고 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 B. subtilis E9-1와 거의 일치하는 것으로 동정되었다. B. subtilis E9-1가 생산하는 박테리오신의 물리화학적 특성을 조사하였고, 박테리오신을 정제하였다. 이 박테리오신은 B. cereus KCCM 11204, M. luteus IAM 1056, L. monocytogenes KCCM 40307, E. faecium KCCM 12118 및 S. aureus subsp. aureus KCCM 40050 등에 대해서 항균활성을 나타내었다. pH 2.0~8.0 범위에서는 안정하였으나 8.0 이상에서는 항균활성이 감소하였다. Isopropanol, ethanol 및 methanol 등의 유기용매에서 100%까지, acetone과 acetonitrile에서는 80%까지 항균활성을 유지하였다. 내열성의 경우 $40{\sim}100^{\circ}C$에서 60분까지는 안정하게 항균활성을 보였다. 박테리오신 농도를 증가시키면서 B. cereus, L. monocytogenes, E. faecium 및 S. aureus subsp. aureus 등 시험균 4주의 감수성을 조사한 결과 농도 의존적으로 시험균의 생육이 감소하였고 이중 L. monocytogenes 의 감수성이 가장 높게 나타났다. 박테리오신의 작용양상을 알아본 결과 B. cereus와 L. monocytogenes 배양액에 박테리오신 용액을 첨가한 후 흡광도와 CFU값이 감소하여 bactericidal임을 확인하였다. 식품에 적용 가능성을 알아보기 위해 실험한 결과 3일째부터 박테리오신을 처리하지 않은 대조구에 비해 실험구에서 생균수(CFU/ml)가 감소하였다. 아세톤을 이용한 배양상등액의 농축, superdex peptide HR 10/300 column 이용한 겔여과크로마토그래피, 역상 HPLC로써 박테리오신을 정제하였다. 역상 HPLC를 통해서 정제한 박테리오신의 분자량을 tricine SDS- PAGE로 분석한 결과 약 4 kDa이었고 질량분석법으로 측정한 정확한 분자량은 3347.6 Da로 나타났다.

Interleukin-4 and -8 Gene Polymorphisms and Risk of Gastric Cancer in a Population in Southwestern China

  • Pan, Xiong-Fei;Wen, Ying;Loh, Marie;Wen, Yuan-Yuan;Yang, Shu-Juan;Zhao, Zhi-Mei;Tian, Zhi;Huang, He;Lan, Hui;Chen, Feng;Soong, Richie;Yang, Chun-Xia
    • Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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    • 제15권7호
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    • pp.2951-2957
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    • 2014
  • Background: Gastric carcinogenesis is a complicated process that involves environmental and genetic factors like interleukin-4 (IL-4) and IL-8. Single nucleotide polymorphisms in their genes are associated with changed levels of gene expression. Here, we investigated the association between IL4-590 C>T and IL8-251T>A and gastric cancer (GC) risk in Sichuan of Southwestern China. Materials and Methods: We surveyed the research subjects using a self-designed questionnaire with questions on demographic factors and putative risk factors. Approximately 2-5ml of whole blood was collected after field survey to analyze IL4-590 C>T and IL8-251T>A genotypes using MALDI-TOF MS. Results: Our study recruited 308 pairs of GC patients and controls, including 224 (72.7%) men and 84 (27.3%) women in each group. There were 99 cardia and 176 noncardia GC patients in the case group. The case and control groups had an average age of $57.7{\pm}10.6$ ($mean{\pm}SD$) and $57.6{\pm}11.1$ years. GC patients reported a significantly greater proportion of family history of cancer (29.9% vs 10.7%, p<0.01) and drinking (54.6% vs 43.2%, p<0.01) than did controls. Variant genotypes of IL-4-590 C>T and IL-8-251 T>A were not associated with overall GC risk (adjusted OR, 0.89; 95%CI, 0.61-1.28 for CT or CC vs TT; adjusted OR, 1.14; 95%CI, 0.86-1.79 for TA or AA vs TT). Stratification analysis of two SNPs for risk by subsites only found that variant IL-8-251 TA or AA genotype was associated with increased noncardia GC risk (adjusted OR, 2.58; 95%CI, 1.19-5.57). We did not observe interactions between the IL-8-251 T>A genotype and smoking (adjusted OR, 0.38; 95%CI, 0.08-1.79) or drinking (adjusted OR, 0.36; 95%CI, 0.08-1.65) for risk of noncardia GC. Conclusions: Our data indicate no association between the two SNPs of IL-4-590 and IL-8-251 with overall GC risk, while the IL-8-251 TA or AA genotype conferred risk of cardia GC. Our findings contribute to the evidence body for risk of SNPs associated with the development of gastric cancer in this region.

쌀보리 종실 내 미생물 분포와 생균제 접종이 발효특성에 미치는 영향 (Effect of Microbial Flora and Inoculation of Probiotics on Fermenting Characteristics of Naked Barley Grain (Hordeum Vulgare L.))

  • 안혜진;김기현;조은석;김조은;김광식;김영화;송태화;박종호;강환구;장선식;오영균;천동원;설국환
    • 한국초지조사료학회지
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    • 제35권4호
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    • pp.321-326
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    • 2015
  • 본 시험은 동계작물인 쌀보리의 알곡에 대한 사료로서의 활용도를 제고하고자 미생물 분포를 분석하고, 발효과정중 이화학적 및 미생물학적 특성의 변화 분석을 통하여 효과적인 발효사료 제조방법을 제시하고자 수행하였다. 즉, 수확된 쌀보리 종실에 시판 생균제를 기준에 맞게 접종한 후 공기와 접촉하지 않도록 밀봉하여 $37^{\circ}C$에서 7일간 발효를 통해 쌀보리 종실의 저장성과 안전성을 증진시킬 수 있다. 쌀보리 종실 자체에 Staphylococcus속과 Bacillus속의 미생물들이 다수 존재하여 자연발효의 가능성이 있음을 보여 주었다. 또한 생균제를 접종하지 않은 쌀보리 종실도 기간이 경과됨에 따라 산도가 저하되고 유산균 수가 증가하여 발효가 이루어지고 있는 것으로 나타났다. 그러나 쌀보리 종실에 생균제를 접종하였을 경우, 발효 7일차에 pH가 $4.33{\pm}0.02$로 발효가 더 빨리 진행되었으며, 유산균의 수도 전체 발효기간 동안 미 접종 대조구에 비해 높게 유지되었으나, 효모의 수에 있어서는 차이가 나타나지 않았다. 발효에 의해 쌀보리 종실의 산도가 저하됨에 따라 초기 $10^7cfu/g$ 이상 검출되었던 대장균이 발효 7일차 이후부터는 전혀 검출되지 않아 발효가 쌀보리 종실의 안전성을 유지시키는 데 있어 효과적인 저장방법으로 나타났다.

나노 입자 불가사리 펩타이드의 면역 활성 증진 (Enhancement of Immune Activities of Peptides from Asterias amurensis Using a Nano-encapsulation Process)

  • 정향숙;오성호;김승섭;정명훈;최운용;서용창;최근표;김진철;이현용
    • 한국식품과학회지
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    • 제42권4호
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    • pp.424-430
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    • 2010
  • 본 연구는 기존의 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드, 저분자화된 펩타이드, 저분자화 된 펩타이드의 젤라틴 나노입자의 비교를 통해 면역 활성의 증진을 확인하였다. 불가사리 펩타이드는 Sephadex G-75 gel 크로마토그래피 분리를 통해 5-7 kDa 범위의 분자량 범위의 시료를 얻었고, MALDI-TOF MS 분석에 의해 펩타이드의 정확한 분자량을 측정하였다. 0.1% collagenase를 처리한 펩타이드의 분자량은 기존의 불가사리 콜라겐 유래 펩타이드에 비해 약 2,000 m/z까지 분자량이 감소되는 효과를 보였다. 이는 2개의 폴리펩티드결합으로 상호 결합되어 감겨있던 콜라겐형구조가 collagenase의 작용으로 풀어진 후 효소의 영향을 받아 가수분해되었기 때문인 것으로 사료된다. 이후 $20^{\circ}C$에서 젤라틴으로 시료를 나노입자화 하여 TEM 및 DLS로 분포와 크기를 각각 확인하였다. 이후 인간섬유아세포에 대한 세포독성 측정 결과, 나노입자화 한 ALPG가 최고 농도인 1.0 mg/mL의 농도에서 11.64%로 가장 낮게 나타났다. 각 시료의 면역물질의 분비 정도를 확인하기 위해 macrophage에서의 $NO^-$ 분비를 측정하였는데 역시 나노 입자화 한 ALPG가 $40\;{\mu}M$로 가장 높은 $NO^-$ 생성량을 보였다. 또한 불가사리 나노 시료가 저분자 추출물과 비교해 B cell 생육도를 10% 이상 향상시켰다. UV 자극에 의해 형성되는 염증물질로 잘 알려진 prostaglandin의 생성을 정량하기 위해 $PGE_2$ 방법을 이용하였는데, 나노입자를 가해준 모든 군에서 농도 의존적으로 $PGE_2$의 생성이 감소하였고 역시 ALPG가 860 pg/mL로 $PGE_2$를 가장 적은 농도로 생성하였다. 마지막으로 confocal 현미경을 이용해 인간 면역 세포에 나노입자가 얼마나 효과적으로 침투하는지를 관찰하였는데 나노 시료의 경우 입자의 크기가 50-200 nm로 분산됨에 따라 일반 불가사리 펩타이드에 비해 세포 침투의 용이성이 크게 증진되는 것을 확인하였다.

효소가수분해 도계부산물의 급여가 육계의 생산성 및 혈액 생화학적 특성에 미치는 영향 (Effects of Feeding Enzyme-Hydrolyzed Poultry By-Product Meal on Productivity and Blood Biochemical Characteristics in Broilers)

  • 곽민근;박혜성;김봉기;박희복;김지혁
    • 한국가금학회지
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    • 제48권3호
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    • pp.133-142
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    • 2021
  • 본 연구는 단백질원으로서 가수분해 도계부산물(Enzyme-hydrolyzed poultry by-product meal)이 도계부산물(Poultry by-product meal) 및 대두박(Soybean meal)과 비교하여 육계의 생산성 등에 미치는 효과를 조사하고자 수행하였다. 실험에 사용된 가수분해 도계부산물은 SDS-PAGE와 MALDI-TOF 분석을 통해 가수분해가 잘 이루어져 저분자화 된 것을 확인하였다. 육계 300수를 이용해 1일령~35일령까지 3처리 5반복, 반복당 20수씩 배치하여 급여 실험을 한 결과, 가수분해 도계부산물(EHPBM) 처리구는 종료 시 평균체중 1,853±125.60 g으로 도계부산물(PBM) 처리구 1,723±76.81 g, 대두박(SBM) 처리구 1,545±62.31 g 보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 전 기간 사료요구율은 가수분해 도계부산물(EHPBM) 처리구에서 1.74±0.064로 도계부산물(PBM) 처리구 1.67±0.060, 대두박(SBM) 처리구 1.65±0.053보다는 높게 나타났다(P<0.05). 이는 도계부산물(PBM) 및 가수분해 도계부산물(EHPBM) 처리구에서 대두박(SBM) 처리구에 비해 유의적으로 증가한 사료섭취량에 기인하는 것으로 보이며, 결과적으로 생산성 향상에 긍정적인 효과를 미친 것으로 판단된다. 각종 장기 무게에서는 대부분 유의성 있는 차이를 보이지는 않았고, F낭 무게에서는 유의차가 나타났으나 차이는 크지 않아 단백질 공급원이 각 처리구의 면역력에 명확한 영향을 주었다고 판단하기는 어렵다. 혈청 생화학 특성에서는 AST와 ALP가 가수분해 도계부산물(EHPBM) 처리구와 도계부산물(PBM) 처리구에서 유의적으로 높게 나타났다. 이는 이들 처리구의 증가한 사료섭취량과 급격한 체중 증가가 간에 영향을 미쳤기 때문인 것으로 추측된다. 결론적으로 가수분해 도계부산물은 육계의 생산성 향상에 효과적이며, 관행적인 단백질 원료들의 대체제로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

Brief Introduction of Research Progresses in Control and Biocontrol of Clubroot Disease in China

  • He, Yueqiu;Wu, Yixin;He, Pengfei;Li, Xinyu
    • 한국균학회소식:학술대회논문집
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    • 한국균학회 2015년도 춘계학술대회 및 임시총회
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    • pp.45-46
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    • 2015
  • Clubroot disease of crucifers has occurred since 1957. It has spread to the whole China, especially in the southwest and nourtheast where it causes 30-80% loss in some fields. The disease has being expanded in the recent years as seeds are imported and the floating seedling system practices. For its effective control, the Ministry of Agriculture of China set up a program in 2010 and a research team led by Dr. Yueqiu HE, Yunnan Agricultural University. The team includes 20 main reseachers of 11 universities and 5 institutions. After 5 years, the team has made a lot of progresses in disease occurrence regulation, resources collection, resistance identification and breeding, biological agent exploration, formulation, chemicals evaluation, and control strategy. About 1200 collections of local and commercial crucifers were identified in the field and by artificiall inoculation in the laboratories, 10 resistant cultivars were breeded including 7 Chinese cabbages and 3 cabbages. More than 800 antagostic strains were isolated including bacteria, stretomyces and fungi. Around 100 chemicals were evaluated in the field and greenhouse based on its control effect, among them, 6 showed high control effect, especially fluazinam and cyazofamid could control about 80% the disease. However, fluzinam has negative effect on soil microbes. Clubroot disease could not be controlled by bioagents and chemicals once when the pathogen Plasmodiophora brassicae infected its hosts and set up the parasitic relationship. We found the earlier the pathogent infected its host, the severer the disease was. Therefore, early control was the most effective. For Chinese cabbage, all controlling measures should be taken in the early 30 days because the new infection could not cause severe symptom after 30 days of seeding. For example, a biocontrol agent, Bacillus subtilis Strain XF-1 could control the disease 70%-85% averagely when it mixed with seedling substrate and was drenching 3 times after transplanting, i.e. immediately, 7 days, 14 days. XF-1 has been deeply researched in control mechanisms, its genome, and development and application of biocontrol formulate. It could produce antagonistic protein, enzyme, antibiotics and IAA, which promoted rhizogenesis and growth. Its The genome was sequenced by Illumina/Solexa Genome Analyzer to assembled into 20 scaffolds then the gaps between scaffolds were filled by long fragment PCR amplification to obtain complet genmone with 4,061,186 bp in size. The whole genome was found to have 43.8% GC, 108 tandem repeats with an average of 2.65 copies and 84 transposons. The CDSs were predicted as 3,853 in which 112 CDSs were predicted to secondary metabolite biosynthesis, transport and catabolism. Among those, five NRPS/PKS giant gene clusters being responsible for the biosynthesis of polyketide (pksABCDEFHJLMNRS in size 72.9 kb), surfactin(srfABCD, 26.148 kb, bacilysin(bacABCDE 5.903 kb), bacillibactin(dhbABCEF, 11.774 kb) and fengycin(ppsABCDE, 37.799 kb) have high homolgous to fuction confirmed biosynthesis gene in other strain. Moreover, there are many of key regulatory genes for secondary metabolites from XF-1, such as comABPQKX Z, degQ, sfp, yczE, degU, ycxABCD and ywfG. were also predicted. Therefore, XF-1 has potential of biosynthesis for secondary metabolites surfactin, fengycin, bacillibactin, bacilysin and Bacillaene. Thirty two compounds were detected from cell extracts of XF-1 by MALDI-TOF-MS, including one Macrolactin (m/z 441.06), two fusaricidin (m/z 850.493 and 968.515), one circulocin (m/z 852.509), nine surfactin (m/z 1044.656~1102.652), five iturin (m/z 1096.631~1150.57) and forty fengycin (m/z 1449.79~1543.805). The top three compositions types (contening 56.67% of total extract) are surfactin, iturin and fengycin, in which the most abundant is the surfactin type composition 30.37% of total extract and in second place is the fengycin with 23.28% content with rich diversity of chemical structure, and the smallest one is the iturin with 3.02% content. Moreover, the same main compositions were detected in Bacillus sp.355 which is also a good effects biocontol bacterial for controlling the clubroot of crucifer. Wherefore those compounds surfactin, iturin and fengycin maybe the main active compositions of XF-1 against P. brassicae. Twenty one fengycin type compounds were evaluate by LC-ESI-MS/MS with antifungal activities, including fengycin A $C_{16{\sim}C19}$, fengycin B $C_{14{\sim}C17}$, fengycin C $C_{15{\sim}C18}$, fengycin D $C_{15{\sim}C18}$ and fengycin S $C_{15{\sim}C18}$. Furthermore, one novel compound was identified as Dehydroxyfengycin $C_{17}$ according its MS, 1D and 2D NMR spectral data, which molecular weight is 1488.8480 Da and formula $C_{75}H_{116}N_{12}O_{19}$. The fengycin type compounds (FTCPs $250{\mu}g/mL$) were used to treat the resting spores of P. brassicae ($10^7/mL$) by detecting leakage of the cytoplasm components and cell destruction. After 12 h treatment, the absorbencies at 260 nm (A260) and at 280 nm (A280) increased gradually to approaching the maximum of absorbance, accompanying the collapse of P. brassicae resting spores, and nearly no complete cells were observed at 24 h treatment. The results suggested that the cells could be lyzed by the FTCPs of XF-1, and the diversity of FTCPs was mainly attributed to a mechanism of clubroot disease biocontrol. In the five selected medium MOLP, PSA, LB, Landy and LD, the most suitable for growth of strain medium is MOLP, and the least for strains longevity is the Landy sucrose medium. However, the lipopeptide highest yield is in Landy sucrose medium. The lipopeptides in five medium were analyzed with HPLC, and the results showed that lipopeptides component were same, while their contents from B. subtilis XF-1 fermented in five medium were different. We found that it is the lipopeptides content but ingredients of XF-1 could be impacted by medium and lacking of nutrition seems promoting lipopeptides secretion from XF-1. The volatile components with inhibition fungal Cylindrocarpon spp. activity which were collect in sealed vesel were detected with metheds of HS-SPME-GC-MS in eight biocontrol Bacillus species and four positive mutant strains of XF-1 mutagenized with chemical mutagens, respectively. They have same main volatile components including pyrazine, aldehydes, oxazolidinone and sulfide which are composed of 91.62% in XF-1, in which, the most abundant is the pyrazine type composition with 47.03%, and in second place is the aldehydes with 23.84%, and the third place is oxazolidinone with 15.68%, and the smallest ones is the sulfide with 5.07%.

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흑색종에서의 I-131표지 혈관내피세포성장인자 수용체2항체를 이용한 방사면역치료 평가 (Evaluation of the Radioimmunotherapy Using I-131 labeled Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2 Antibody in Melanoma Xenograft Murine Model)

  • 김은미;정환정;박은혜;정수진;이창문;장규윤;김동욱;임석태;손명희
    • Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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    • 제42권4호
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    • pp.307-313
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    • 2008
  • 목적: 혈관내피성장인자(VEGF)와 그 수용체는 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 한다 3개의 수용체가 알려져 있는데 그 중에서도 VEGFR2 (Flk-1/KDR)가 종양 angiogenesis에 매우 밀접하게 관련한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101에 I-131을 표지하여 매우 공격적인 종양으로 알려진 흑색 종의 치료 정도를 확인해 보고자 하였다. 방법: 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131을 표지하였다. 누드마우스에 B16F10세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 $200-250\;mm^3$으로 키워 $^{131}I$-DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다. 흑색종 동물모델을 5개 군으로 나누어 각각 치료를 시행하였다. 1군은 PBS만을, 2군은 $^{131}I$-DC101 $50\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 3군은 DC101 $50\;{\mu}g$을, 4군은 $^{131}I$-DC101 $30\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 5군은 $^{131}I$-DC101 $15\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을 각각 매 3일 ${\sim}$ 4일마다 주사하고 전체 5회를 주사하였고 종양볼륨을 측정하였다. 결과: $^{131}I$-DC101을 흑색종 모델에 정맥주사하고 78시간까지 영상을 얻은 결과 시간에 따라 종양섭취가 증가 하는 영상을 보였다. 시간대별 장기섭취를 정확히 확인하기 위하여 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 장기섭취율을 비교한 결과 시간에 따라 혈액내 방사능치가 서서히 감소하였고 다른 장기의 섭취도 시간에 따라 감소하였고 종양의 섭취는 48시간까지 증가하였다가 그 이후는 감소하였다. 흑색종 동물모델에 $^{131}I$-DC101 치료를 시행한 결과 3번째 주사까지는 각군간의 유의한 차이를 보이지 않다가 4번째 주사를 시행한 때부터 1군과 2군, 또는 1군과 4군간의 유의한 차이를 보이기 시작했다. 또한 5번째 주사 이후에는 5군에서도 유의한 차이를 보여 I-131 에 의한 효과가 뚜렷해짐을 확인하였다. 결론 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101을 흑색종 모델에 정맥내 주사하였을 때, 종양성장억제 효과를 보이지 않는 항체양에서도 I-131을 표지하여 치료를 시행했을 경우에는 효율적인 종양성장억제 효과를 보였다.