A bacteriocin was isolated from the supernatant fluid of M17G broth culture of Lactococcus sp. HY 449 strain, which showed strong inhibitory activity against the growth of selective indicator strain, Lactobacillus fermentum IFO3023. When the bacteriocin wasa added to the growing indicator cells or cell suspensions, viable cells and optical density were density were decreased, indicating bacteriolytic mode of action. Electron microscopic observation of indicator cells treated with bacteriocin revealed apparent damages on the cell surface and eventual lysis of cell walls.
Immunositmulation effects of the mice fed with the cell lysate of Lactobacillus plantarum isolated from Kimchi were studied. The mice group fed with cell lysate was different from the control group on the degree of immune responses, e.g. 1) proliferation of splenocytes and Peyer's patch cells, 2) production of nitric oxide (NO) by peritoneal macrophages, 3) production of intestinal secretory lgA (slgA), 4) variation of TNF-${\alpha}$ and IL-2 concentration in blood, 5) production of specific lgG against sheep red blood cells. A general enhancement in enteric and systemic immune responses was observed with a simple oral administration of immunostimulators. With the oral feeding of L. plantarum, not only the total amount of gut secretion antibody, but also the binding capacity of antibodies to the enteric microorganisms including L. plantarum was increased. These experimental results clearly showed that the oral feeding of immunostimulators gave multifunctional effects on the mucosal and systemic immune systems of mice.
The intestinal microbiota are important to the host with regard to resistance they impart against bacterial infections and their involvement in mediating metabolic functions. Lactic acid producing bacteria such as Lactobacillus play an important physiological role in these matters. The aim of the present study was to isolate Lactobacillus sp. that inhibits enteric pathogens. Initially, 17 isolates from healthy Koreans were collected on Lactobacillus selective medium. Resistance of the isolates to antibiotics including rifampicin, streptomycin, clindamycin and vancomycin was measured. One of the isolate was identified as Lactobacillus ruminus on the basis of bacterial cell morphology, cultural characteristic and biochemical characteristics, 16S rRNA sequence analysis and PCR-RAPD. Antimicrobial activity of the bacterium against Vancomycin Intermediate Resistant Staphylococcus aureus (VISA) and Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) was measured. About $10^4$ cells of VISA or VRE were mixed with 1, 5, and 9 mL of L. ruminus SPM 0211 and the final volume was adjusted to 10 mL with brain heart infusion (BHI) broth. The cell suspension was incubated for 3, 6, 9, and 24 h, serially diluted and then plated on BHI agar plates. As numbers of L. ruminus SPM 0211 were increased, viable cell count of VISA and VRE decreased. The strongest antimicrobial activity of SPM 0211 was observed after 9 h incubation in any mixture, almost completely inhibiting the growth of these two bacteria. The results suggest that the freshly isolated L. ruminus SPM 0211 may be used as a pro-biotic microbe that prevents the colonization of enteric pathogens and can thereby promote good gastrointestinal health.
본 실험을 수행하기 위해 EPS를 생산하지 않는 Lactobacillus paracasei KLB58의 돌연변이주를 NTG mutagenesis 방법을 사용하여 선별하였다. 선별된 돌연변이주의 숙주에 대한 부착능을 연구하기 위해 세포 표면의 소수성의 변화에 관하여 연구가 진행되었다. 정량적인 측정을 위해 hydrocarbon의 한 종류인 hexadecane을 소수성층으로 사용하여 세포와 함께 섞이는 kinetics를 측정하였다. 실험결과 KLB58의 돌연변이주는 야생형에 비해 세포표면이 상대적으로 높은 소수성을 나타내었다.
우수한 생균제를 개발하기 위하여 안전성이 알려진 유산균을 대상으로 인체의 분변으로부터 300여 균주를 분리하고 내산성, 내담즙성, 내열성, 항균력, 항암 및 항바이러스 효과를 가지는 균주들을 선발하여 생균제 특성을 나타내는지를 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. 인체에서 분리한 여러 균주 중 Miny-148 균주는 낮은 pH 및 높은 담즙산에 대한 내성, 열처리에 대한 열안정성을 지녀 기초적인 probiotic 특성을 가진 균주로 선발되어, Lactobacillus pentosus (99.9% 상동성)로 동정되었다. 항균력 실험에서 Escherichia coli O157:H7을 비롯한 Shigella flexneri, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus, E. coli, Vibrio cholerae, V. vulnificus, Salmonella typhimurium, 그리고 및 methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 균주 8종 등 총 16종의 병원성세균을 억제하였다. 또한 Miny-148은 결장암 세포인 HT-29 cell을 억제하였을 뿐 아니라, transmissible gastroenteritis virus의 생육을 저해하여 세포변성 억제효과를 가진 우수한 probiotic 특성을 지닌 균주로 분석되었다.
Lactobacillus sp. GM7311이 생산하는 박테리오신의 작용 특성을 알아보기 위하여, 배양이 진행 중인 세 가지 시험균주의 TSB 배양액에 일정한 시간 간격별로 최종 농도 100 BU/ml가 되도록 박테리오신을 첨가한 후 그 균수 변화와 작용 특성을 살펴보았다. 시험 균주의 증식 시기별로 박테리오신을 첨가한 경우 Proteus mirabilis의 경우는 대수증식기 중기 이전까지의 지시균에 대해서 강한 억제작용을 보이는 반면, Vibrio parahaernolricus와 Escherichia coli는 첨가 시기 모두에서 급격한 균수 감소를 보였으며 다만 정지기에 있어서는 저해 효과가 적었다. 또한 박테리오신을 처리한 세 가지 시험 균주를 전자현미경으로 관찰했을 때, Lactobacillus sp. GM7311이 생산하는 박테리오신은 시험 균주의 세포벽 파괴와 함께 세포 내용물을 유출시키는 bacteriolytic action 형태를 보였다. 증식 시기별로 박테리오신을 첨가하여 각 균주별로 가장 큰 영향을 받은 증식시기를 선택해서 박테리오신을 처리한 후, 아미노산 및 지방산 조성을 분석하여 박테리오신을 처리하지 않은 대조구와 비교하였다. 이 실험에서 아미노산의 경우는 세 균주 모두에서 대부분의 성분이 크게 감소하는 경향을 보였으며, 지방산은 크게 감소하는 성분은 없었지만 각 성분들의 함량이 대체적으로 증가하거나 감소하는 변화를 나타내었다.
Lactobacillus plantarum 용균 효소를 생산하는 균주를 배양하여 생산된 효소를 정제한 결과 비활성도가 5.8 units/mg protein 이었고 정제도 8.3배, 수율은 30%이었다. 정제효소의 분자량은 gel filtration과 SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis를 이용하여 측정한 결과 60,000 kDa 이었다. 용균 효소의 최적 반응 시간은 20분이었으며 최적 온도는 4$0^{\circ}C$, 최적 pH는 3.0이었다. 온도 안정성은 각 온도에서 30분간 처리하였을 때 $30^{\circ}C$까지는 안정하였으나 4$0^{\circ}C$에서는 80% 활성을 나타내었다. 효소의 pH 안정성은 실온에서 1시간 처리하였을 때 pH 4~7에서 안정성을 나타내었다.
염 농도$(0{\sim}3%)$와 발효 온도$(4,\;15,\;25^{\circ}C)$를 달리 하였을 때 물김치의 미생물 균총의 특성에 대한 결과는 다음과 같다. 무 물김치의 경우 총 균수는 숙성온도가 높을수록, 염 농도가 낮을수록 높게 나타났으나, 배추 물 김치의 경우 염 농도별 뚜렷한 차이를 보이지는 않았다. Lactobacillus, Lenconostoc 속 균수는 염 농도 1.0% 숙성 김치에서 가장 높게 나타났고, 배추 물김치는 $4^{\circ}C$에서 염 농도 3.0% 시료가 가장 낮은 값을 보였으며, 그 외 시료들은 온도별, 염 농도별 큰 차이가 없었다. Streptococcus 속과 Pediococcus 속은 Leuconostoc, Lactobacillus속 보다 낮은 분포를 보였고, 염 농도 1.0% 숙성 김치에서 가장 높게 나타났으며 이는 배추 물김치에서도 같은 경향을 보여주었다. 대장균수와 Gram (-)균수는 염 농도 3.0% 김치가 균수도 적었고 초기에 증가하였다가 젖산균이 증식하여 산도가 증가하면 그 수가 감소되었다. 효모는 발효 초기에는 발견되지 않다가 발효 후기에 증가하였으며 온도와 염 농도가 높을수록 균수가 증가하였다. 배추 물김치에서도 $15,\;25^{\circ}C$에서 염 농도가 높은 시료에서 비교적 높게 계수되어 무 물김치와 유사한 경향을 보였으나 배추 물김치의 경우 초기부터 효모가 계수되어 주재료간 차이를 보였다. 각각의 선택배지에서 순수분리, 동정된 균은 무 물김치의 경우 젖산균류는 염 농도 0.2% 김치에서는 Lactobacillus plantarum, L. pentosus, Leuconostoc citrum, 염 농도 1.0% 김치에서는 L. plantarum, L. pentosus, Leu.mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Streptococcus facium이 동정되었고, 염 농도 3.0% 김치에서는 L. plantarum, L. brevis, Leu. mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Str. facium이 각각 분리 동정되었으며 Pediococcus는 미확인되었다. Gram (-)균과 효모는 공통적으로 Gram (-)균으로는 Aeromonas hydrophila, 효모로는 Candida pelliculosa가 각각 분리 동정되었다. 배추 물김치의 경우 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc citrum, Leu. mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Streptococcus facium이 동정되었으며, Pediococcus는 역시 미확인되었다. Gram (-)균은 Pseudomonas fluorescens, Pseu. aureofaciens가 각각 분리 동정되어 주재료간 차이를 보여주었다.
젖산균에 의한 항돌연변이원 활성의 특성을 구명하기 위하여 돌연변이원 물질 2-nitrofluorene에 대한 Lactobacillus spp.와 Bifidobacterium spp.의 항돌연변이원 활성의 균주간의 차이, 활성의 분포 및 활성의 최적조건을 Salmonella typhimurium TA 98을 이용하여 측정하였다. Lactobacillus spp.와 Bifidobacterium spp.는 평균 20.29% 수준의 억제활성을 보였고 Lactobacillus spp.는 20.53%와 Bifidobacterium spp.는 21.63%의 억제활성을 나타내었으며 균주별로 가장 큰 활성을 보인 균주는 L. plantarum CU 722로서50.34%의 억제활성을 나타내었다. L. plantarum CU 722의 탈지유 배양액에서 항돌연변이 활성의 분포를 측정하였던 바 세포벽 성분 및 세포질 성분에서 34.91%와 24.48%로 높은 활성을 보인 반면 세포를 함유하지 않은 배양액에서는 매우 낮은 활성이 나타났다. 항돌연변이 활성을 나타내는 조건으로 균주의 배양시간은 24시간 배양액에서, 돌연변이원 물질과 젖산균 배양액 및 시험균주와의 예비배양시간은 60분으로 유지할 때, 배양시간은 48시간 이상으로 할 때 가장 높은 항돌연변이 활성을 보였다.
Objectives : Recently the case of lactobacillus mixture culture fluid appliment was reported. In this study, anti-inflamation effects and anti-allergy effects were studied by stimulus of lactobacillus mixture culture fluid extracts in HaCaT cells. Methods : The atopic dermatitis were induced by TNF-${\alpha}$ and interferon-${\gamma}$ in HaCaT cells. TARC/CCL17, MDC/CCL22, RANTES/CCL5 and ROS production were investigated to explain anti-inflamation and allergy effects of lactobacillus mixture culture fluid with cell-enzyme-linked Immunosorbent assay in 450 nm, 485 nm, 535 nm with spectro-fluorometer. Results : The extracts of lactobacillus mixture culture fluid were decreased TARC/CCL17, MDC/CCL22, RANTES/CCL5 expressions and ROS production with a concentration dependent manner. Conclusions : The effects mechanism of Lactobacillus mixed culture fluid for atopic dermatitis symptoms were considered to be explain anti-inflamation and allergy effects via control of cytokine, chemokine and ROS production, and the fluid could be applied in skin cells directly. But classified AD symptom degrees reported in clinical case before as Reaction Period, Reduction Period, Effect Period, Reproduction Period and Rebound Period could not be explained. Further study will be expected.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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