• 한국수정란이식학회지
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• 제24권1호
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• pp.39-45
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• 2009

This study was carried out to evaluate the nuclear, cytoplasmic maturation and developmental potential of bovine oocytes selected by brilliant cresyl blue (BCB) as indirect measurement of oocytes growth phase. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from 2 to 8 mm follicles from slaughterhouse Hanwoo ovaries. The COCs were divided into stained cytoplasm to blue (BCB+) and unstained (BCB-) according to their ooplasm BCB coloration stained by $26{\mu}m$ of BCB after 90 min. Selected COCs were cultured in a TCM 199 for 18 to 26 h. Nuclear maturation and total cell number was evaluated after in vitro maturation (IVM) or in vitro culture (IVC) using $10{\mu}g/ml$ Hoechst 33342, and cytoplasmic maturation was evaluated by intracellular glutathione (GSH) assay before (0 h) and after (24 h) IVM. The oocyte diameters were not differed significantly between BCB+ ($157.4{\pm}5.8{\mu}m$) and BCB+ ($149.0{\pm}31.0{\mu}m$) groups (p>0.05). However, the proportion of metaphase II oocytes in BCB+ group was significantly higher than BCB- group after IVM (p<0.05). GSH content of BCB+ group oocytes was significantly higher than that of BCB- group just after collection ($7.3{\pm}0.6$ vs. $4.8{\pm}0.6\;pmol/oocyte$, p<0.05), but not varied after IVM($13.1{\pm}0.9$ and $12.6{\pm}2.5\;pmol/oocytes$ for BCB+ and BCB- respectively; p>0.05). The proportion of blastocyst formation and total cell number in BCB+ group (23.5% and $105.5{\pm}28.6$) was significantly higher than that in BCB- (9.8% and $72.4{\pm}26.1$; p<0.05). The results indicate that BCB+ group oocytes may provide a cellular and functional basis for the greater developmental competence in Korean Native Cow (KNC) oocytes.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제32권2호
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• pp.187-194
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• 2022

Two α-ʟ-arabinofuranosidases (BfdABF1 and BfdABF3) and a β-ᴅ-xylosidase (BfdXYL2) genes were cloned from Bifidobacterium dentium ATCC 27679, and functionally expressed in E. coli BL21(DE3). BfdABF1 showed the highest activity in 50 mM sodium acetate buffer at pH 5.0 and 25℃. This exo-enzyme could hydrolyze p-nitrophenyl arabinofuranoside, arabino-oligosaccharides (AOS), arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) such as 3²-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylobiose (A³X), and 2³-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylotriose (A²XX), whereas hardly hydrolyzed polymeric substrates such as debranched arabinan and arabinoxylans. BfdABF1 is a typical exo-ABF with the higher specific activity on the oligomeric substrates than the polymers. It prefers to α-(1,2)-ʟ-arabinofuranosidic linkages compared to α-(1,3)-linkages. Especially, BfdABF1 could slowly hydrolyze 2³,3³-di-α-ʟ-arabinofuranosyl-xylotriose (A²⁺³XX). Meanwhile, BfdABF3 showed the highest activity in sodium acetate at pH 6.0 and 50℃, and it has the exclusively high activities on AXOS such as A³X and A²XX. BfdABF3 mainly catalyzes the removal of ʟ-arabinose side chains from various AXOS. BfdXYL2 exhibited the highest activity in sodium citrate at pH 5.0 and 55℃, and it specifically hydrolyzed p-nitrophenyl xylopyranoside and xylo-oligosaccharides (XOS). Also, BfdXYL2 could slowly hydrolyze AOS and AXOS such as A³X. Based on the detailed hydrolytic modes of action of three exo-hydrolases (BfdABF1, BfdABF3, and BfdXYL2) from Bf. dentium, their probable roles in the hemiceullose-utilization system of Bf. dentium are proposed in the present study. These intracellular exo-hydrolases can synergistically produce ʟ-arabinose and ᴅ-xylose from various AOS, XOS, and AXOS.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제17권3호
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• pp.127-135
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• 2016

Two-pore 도메인 포타슘 채널(two-pore domain $K^+$ channel, K2P channel)은 세포내 pH, 생리 활성 지질, 신경 전달 물질과 같은 생리학적 자극의 표적이며 안정막전압(resting membrane potential)을 설정하는 것으로 알려져 있다. 일부 유형의 K2P 채널들은 세포 사멸 및 종양 형성 등에서 중요한 역할을 한다. K2P 채널 중 TREK2 채널의 길항제는 보고되지 않았다. 본 연구의 목적은 TREK2 채널을 과발현시킨 HEK293 세포(HEKT2)에서 플라보노이드에 의해 TREK2 채널이 억제되는지 그리고 HEKT2 세포의 증식이 플라보노이드에 의해 영향을 받는지 알아보고자 하였다. 전기생리학적 전류는 단일 채널 patch clamp 방법을 사용하여 기록하였고 세포 증식은 XTT 에세이방법을 이용하여 측정하였다. HEKT2 세포에서 전기생리학적 TREK2 채널 활성도는 에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG) 및 케르세틴과 같은 플라보노이드에 의해 각각 $91.5{\pm}13.1%$(n=5), $82.2{\pm}13.7%$(n=5)까지 억제되었다. 반면, EGCG 유사체인 에피카테킨(EC)는 TREK2 단일 채널 활성도에 현저한 억제 효과는 없었다. 또한 HEKT2 세포에서 세포 증식이 EGCG에 의해 $69.4{\pm}14.0%$(n=4)까지 감소되었음을 확인하였다. 결과로부터 EGCG와 케르세틴이 TREK2 채널 억제제임을 처음으로 확인하였고, EGCG만 HEKT2 세포의 증식을 감소시킨다는 결론을 얻었다. 본 연구의 결과는 EGCG 및 케르세틴이 TREK2 채널을 억제함으로써 막전압의 변화 유도와 세포 증식에 필요한 세포내 신호 변화의 시작을 트리거하는데 일차적으로 작동할 수 있음을 시사한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제19권2호
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• pp.95-104
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• 1995

Mouse mammary epithelial cells(NMuMG) were maintained onto 6-well plates (3$\times$105 cells/well) or chambered slide (1$\times$104 cells/well), in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum. After serum starvation for 24 hours, DMNB (1$\mu$M) was added and exposed to UV light (300nm, 3 second pulse) after 2 hours from DMNB addition in order to activate DMNB which induces a rapid transient increase in intracellular cAMP upon UV irradiation. EGF (100ng/ml) and/or IGF-I (10ng/ml) were treated at the time of UV irradiation. Nuclear labeling index was estimated as percent of nuclear labeled cells(percent of S phase of cells) by incorporation of 3H-thymidine into DNA(1 hour pulse with 1$\mu$Ci/ml). DMNB(1$\mu$M), EGF (100ng/ml) and/or IGF-I (10ng/ml) signifciantly increased nuclear labeling index than those of control (P<0.05). Addition of DMNB＋EGF or DMNB＋EGF＋IGF-I showed the interaction effect in nuclear labeling index (P<0.05). Protein kinase A activities by addition of EGF, IGF-I or EGF＋IGF-I were 10.5, 9.8 or 9.4 unit/mg protein, respectively, and no statistical difference was found in comparison with control (P>0.05). Additon of DMNB＋EGF showed the moderate interaction effect on tyrosyl kinase activity (P<0.1). In the fluorography analysis, there were no specific protein phosphorylation patterns were found at 1 or 15 minute by addition of DMNB. EGF and/or IGF-I. These results suggest that the interaction effect in nuclear labeling index by addition DMNB and EGF could be mediated through the modulation of tyrosyl kinase activity by cAMP.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제7권4호
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• pp.229-236
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• 1997

A gene, $phbC_{2.4.1}$ encoding poly-3-hydroxybutyric acid (PHB) synthase of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was cloned by employing heterologous expression in Escherichia coli. R. sphaeroides chromosomal DNA partially digested with MboI was cloned in pUC19 followed by mobilization into E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$ in pRK415, which code for ${\beta}$-ketothiolase and acetoacetyl CoA reductase of Alcaligenes eutrophus, respectively. Two E. coli clones carrying R. sphaeroides chromosomal fragment of $phbC_{2.4.1}$ in pUC19 were selected from ca. 10,000 colonies. The PHB-producing colonies had an opaque white appearance due to the intracellular accumulation of PHB. The structure of PHB produced by the recombinant E. coli as well as from R. sphaeroides 2.4.1 was confirmed by [$H^{+}$]-nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Restriction analysis of the two pUC19 clones revealed that one insert DNA fragment is contained as a part of the other cloned fragment. An open reading frame of 601 amino acids of $phbC_{2.4.1}$ with approximate M.W. of 66 kDa was found from nucleotide sequence determination of the 2.8-kb SaiI-PstI restriction endonuclease fragment which had been narrowed down to support PHB synthesis through heterologous expression in the E. coli harbouring $phbA,B_{AC}$. The promoter (s) of the $phbC_{2.4.1}$ were localized within a 340-bp DNA region upstream of the $phbC_{2.4.1}$ start codon according to heterologous expression analysis.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권8호
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• pp.1244-1251
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• 2020

Phospholipase A₂ (PLA₂) from Streptomyces violaceoruber is a lipolytic enzyme used in a wide range of industrial applications including production of lysolecithins and enzymatic degumming of edible oils. We have therefore investigated expression and secretion of PLA₂ in two workhorse microbes, Pichia pastoris and Escherichia coli. The PLA₂ was produced to an activity of 0.517 ± 0.012 U/ml in the culture broth of the recombinant P. pastoris. On the other hand, recombinant E. coli BL21 star (DE3), overexpressing the authentic PLA₂ (P-PLA₂), showed activity of 17.0 ± 1.3 U/ml in the intracellular fraction and 21.7 ± 0.7 U/ml in the culture broth. The extracellular PLA2 activity obtained with the recombinant E. coli system was 3.2-fold higher than the corresponding value reached in a previous study, which employed recombinant E. coli BL21 (DE3) overexpressing codon-optimized PLA₂. Finally, we observed that the extracellular PLA₂ from the recombinant E. coli P-PLA₂ culture was able to hydrolyze 31.1 g/l of crude soybean lecithin, an industrial substrate, to a conversion yield of approximately 95%. The newly developed E. coli-based PLA₂ expression system led to extracellular production of PLA₂ to a productivity of 678 U/l·h, corresponding to 157-fold higher than that obtained with the P. pastoris-based system. This study will contribute to the extracellular production of a catalytically active PLA₂.

• 대한화장품학회지
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• 제32권4호
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• pp.263-267
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• 2006

태양광선과 산소는 피부세포에 자유라디칼(free radical)과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시켜 세포막 지질의 과산화와 염증을 유발한다. 본 연구는 자외선에 의한 피부손상에 대한 머위추물물의 피부 보호효과에 대한 것으로 UVB가 조사된 각질형성세포에서이 항산화 및 염증관련 사이토카인의 억제효과를 측정하였다. 라디칼에 의한 지질과산화에 대한 억제효과는 $100{\mu}g/mL$에서 70.1%로 우수하게 나타났으며, 세포내에서 ROS에 의해 형광을 띠는 물질로 전환되는 $CM-H_2DCFDA$를 이용하여 ROS의 양을 측정한 결과 자외선에 의해 증가된 세포내 ROS의 양이 머위추출물을 처리함으로써 $500{\mu}g/mL$ 농도에서 45% 이상의 우수한 소거효과를 나타냈다. 또한 각질형성세포에서 UVB에 의해 생합성이 증가되는 $IL-1{\alpha}$ 및 $PGE_2$의 생합성 억제효과는 $100{\mu}g/mL$에서 각각 25.7%, 59.3%를 저해하는 것으로 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 머위추출물은 각질형성세포에서 자외선 조사에 의한 피부손상에 대한 보호효과를 가진 화장품에서 우수한 소재로 적용될 수 있다.

• 미생물학회지
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• 제51권4호
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• pp.338-346
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• 2015

본 연구는 Schizosaccharomyces pombe의 단백질2황화물이성질화효소 2 (Pdi2)가 수은 독성에 대한 저항성에 관여하는지를 입증하기 위하여, Pdi2 과잉 발현 재조합 플라즈미드 pYPDI2와 대응되는 벡터플라즈미드인 pRS316을 사용하여 수행되었다. 염화제2수은($25{\mu}M$, $50{\mu}M$, $200{\mu}M$)에 노출되었을 때, pYPDI2 포함 S. pombe 세포는 벡터 포함 대조 세포보다 훨씬 더 잘 성장하였다. pYPDI2 포함 S. pombe 세포는, 6시간 동안 염화제2수은과 같이 배양하였을 때, 벡터 포함 대조 세포보다 낮은 세포 내 활성산소종과 일산화질소 수준을 나타내었다. 반면, 같은 배양 조건에서, pYPDI2 포함 S. pombe 세포는 벡터 포함 대조 세포보다 높은 수준의 총 글루타치온 및 수퍼옥시드 디스뮤타아제을 나타내었다. 그러나, pYPDI2 포함 S. pombe 세포는 벡터 포함 대조 세포와 비슷한 수준의 글루타치온과산화효소 활성을 보여 주었다. 종합하면, S. pombe Pdi2는 총 글루타치온과 수퍼옥시드 디스뮤타아제 활성을 증가시켜, 그에 따라 활성산소종과 일산화질소의 상승을 억제함으로써 수은 독성에 대한 저항성에 관여한다.

• 생명과학회지
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• 제17권10호
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• pp.1341-1346
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• 2007

Paenibacillus sp. DG-22로부터 세포내 효소인 ${\beta}-xylosidase$가 이온교환, 소수성 상호작용, 겔여과 크래마토그래피에 의해 순수하게 정제되었다. 이 효소의 분자량은 겔여과에 의해서는 156,000으로, SDS-PACE에 의해서는 80,000으로 측정되었는데 이것은 이 효소가 동일한 두 소단위로 구성되어 있음을 나타낸다. 정제된 효소는 $65^{\circ}C$와 pH 5.5에서 최대 활성을 나타내었다. 이 효소는 $60^{\circ}C$에서 60분까지 초기 활성의 80%를 유지하였고 $65^{\circ}C$에서 25분의 반감기를 가지고 있었다. 이 효소는 기질로서 pNPX에 매우 특이적이었고 다른 p-nitrophenyl 글리코시드들과 자일란에는 활성을 나타내지 않았다. pNPX에 대한 $K_m$과 $V_{max}$는 각각 0.53 mM과 3.18 U/mg단백질이었다. 이 ${\beta}-xylosidase$는 $Ag^+,\;Fe^{2+},\;Hg^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$에 의해 강하게 억제되었으며 DTT에 의해서 약간 활성화되었다. 자일로바이오스, 자일로트라이오스 및 자일로데트라오스로부터의 가수분해 산물은 자일로오스이었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권3호
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• pp.202-208
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• 1997

콩 뿌리조직의 이온 흡수와 관련된 생리활성을 조사하기 위하여 뿌리조직으로부터 마이크로솜을 분리하였고, 마이크로솜 ATPase (이온점프) 활성을 분광학적 방법인 enzyme-coupled 분석방법에 따라 측정하였다. 마이크로솜 ATPase의 활성에 미치는 여러 가지 이온의 효과 또는 ATPase의 이온선택성을 조사하기 위하여 $10mM\;Na^+$과 $120mM\;K^+$을 포함하는 대조용액에서의 평균활성을 측정한 결과 190 nmol/min/mg protein으로 나타났다. 대조활성에 비하여 $Na^+$을 포함하지 않은 $130mM\;K^+$ 용액에서는 활성이 150%로 증가하였고, $K^+$을 포함하지 않은 $130mM\;Na^+$ 용액에서는 활성이 63%로 감소되었다. 반응용액의 $K^+$ 농도에 따른 활성변화를 측정한 결과, ATPase의 활성은 외부용액의 $K^+$ 농도 증가에 따라 활성이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 마이크로솜 ATPase 활성은 반응용액의 pH 감소에 따라 증가되어 $pH\;6{\sim}7$에서는 비교적 높은 활성을 보였으나, pH 8 이상에서는 급격히 활성이 감소되었고, pH 9에서는 80%이상의 활성이 저해되었다. $Ca^{2+}$에 의한 이온펌프의 활성조절 여부를 평가하기 위해서 마이크로솜 내부 및 외부의 $Ca^{2+}$에 의한 ATPase 활성변화를 측정하였다. 마이크로솜 ATPase의 활성은 반응액의 $Ca^{2+}$ 농도가 낮아질수록 증가하여 $10^{-9}M$ 이하에서 최대활성이 관측되었고, $Ca^{2+}$ 농도가 증가할수록 활성은 감소하여 $500\;{\mu}M$ 전후에서 50%의 활성이 감소하였다. 또한 ATPase의 활성은 마이크로솜 내부의 $Ca^{2+}$ 농도증가에 의해서 저해되어, $Ca^{2+}\;ionophore\;A23187$처리에 의한 외부의 $Ca^{2+}$ 유입에 의해서 약30%의 활성감소를 보였으며, EGTA 처리에 의한 $Ca^{2+}\;chelation$에 의해서 마이크로솜 내부의 $Ca^{2+}$ 농도가 감소되었을 때, ATPase 활성은 증가하였다. 위의 조건에서 실제 마이크로솜 내부로의 $Ca^{2+}$ 유입 여부는 $‘Ca^{2+}’$를 이용하여 확인하였다. 이상의 결과는 마이크로솜 막에 위치한 ATPase의 내부 및 외부에 $Ca^{2+}$에 의한 효소활성 조절부위가 각각존재함을 시사한다.