These experiments were conducted to know whether RNA syntheis is involved in the cumulus expansion and oocyte maturation of mouse cumulus-oocyte complexes in vitro. Mouse cumulus-oocyte complexes(COC's) were cultured in the presence of cordycepin, an inhibitior of RNA synthesis and its effect on the cumulus expansion and oocyte maturation were examined. The results were as follows. 1. Continuous presence of cordycepin in the medium(200${\mu}g/ml$) inhibited the HCG-induced cumulus cell expansion of mouse complexes. This inhibition was reversible. 2. When the COC'S were preincubated with different concentration of cordycepin plus HCG for 3 hours and then transferred to the plain medium, the HCG induced cumulus expansion was suppressed at $100{\mu}g/ml$ of cordycepin. 3. When the COC'S were cultured with cordycepin after HCG stimulation(3hrs), the cumulus expansion were not suppressed by cordycepin. 4. Oocyte meiotic maturation did not appear to be affected by cordycepin. The data presented here imply that RNA synthesis is involved in the cumulus expansion process and that mouse oocytes are more resistant to RNA synthesis inhibitor than cumulus cells.
빨간집모기가 흡혈한 후 체내에서 일어나는 total RNA 변화를 조사한 결과 흠혈 후 6시 간 이후에 RNA양이 증가하기 시작하여 18시간에서 peak를 보인 후 감소하다가 30시간째 부터 증가하기 시작하여 48시간 후에 최대의 RNA 양을 보인 후 급격히 감소하였다 난소에서의 RNA 합성을 정량한 결과 흡혈 후 24시간 이전에는 흡혈 전에 비하여 전혀 증가하지 않았고 30시간 이후부터 증가하기 시작하여 48시간에 가장 많은 양의 RNA가 난소내에 존재하였고, 그 후 급격히 감소하였다. 흡혈 후 6시간 간격으로 난소로 부터 total RNA를 추출하여 in vitro translation을 실시하고 TCA 침전법과 면역침전법으로 합성된 3H-protein과 3H-vitellogenin을 정량하였다. 그 결과 흡혈 후 36시간 이후의 난소로부터 3H-protein과 지-vitellogenin의 합성이 일어나기 시작하여 48시간된 난소에서 가장 많은 양의 3H-protein과 3H-vitellogenin이 합성되었으며, 이때 합성된 단백질의 약 45% 정도가 난황단백질인 3H-vitellogenin으로 나타났다 이상의 결과로 빨간집모기에서는 지방체에서 뿐만 아니라 난소에서도 난황단백질의 합성이 일어남을 알수 있다.
The effects of estrogen and androgens on Vg gene expression were examined in primary hepatocyte culture and livers of the immature male trout. Specific primers of Vg cDNA were designed with already reported Vg gene nucleotide sequences. PCR product was sequenced and verified with Vg cDNA of rainbow trout. Total RNA was extracted from the cultured hepatocytes and livers of steroid-treated rainbow trout and then it was analyzed by reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. The Vg mRNA and Vg protein synthesis were increased in rainbow trout in vivo and in vitro with E$_2$ and methyltestosterone (MT) There were dose and time-related effects of E$_2$ and MT on vitellogesis. Androgens such as progesterone androsterone and testosterone also stimulated Vg mRNA expression in vitro. The results show that androgens as well as E$_2$ can induce expression of Vg mRNA in trout in vivo and in vitro.
Cell-free extracts prepared from cultured insect cells, Spodoptera. frugiperda, were analyzed for activation of early gene transcription of an insect baculovirus, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). The template DNA used for in vitro transcription assays contained promoter sites for the baculovirus genes that have been classified as immediate early ($\alpha$) or early genes. These genes are located in the HindIII-K/Q region of the AcNPV genome. Nuclei isolated from the AcNPV-infected Spodoptera frugiperda cells were also used for in vitro transcription analysis by RNase-mapping the labeled RNA synthesized from in vitro run-on reaction in the isolated nuclei. The genes studied by this technique were p26 and pl0 genes which were classified as delayed early and late gene, respectively. We found that transcription of the genes from the HindIII-K region was accurately initiated and unique in the whole cell extract obtained from uninfected cells, although abundance of the in vitro transcripts was reverse to that of in vivo RNA. With isolated nuclei transcription of the p26 gene was inhibited by $\alpha$-amanitin suggesting that the p26 gene was transcribed by host RNA polymerase II. However, transcription of the pl0 gene in isolated nuclei was not inhibited by $\alpha$-amanitin, but rather stimulated by the inhibitor. We also found that the synthesis of $\alpha$-amanitin-resistant RNA polymerase was begun before 6 hr p.i., the time point at which the onset of viral DNA replication as well as the appearance of a-amanitin-resistant viral transcripts were detected. These studies give us strong evidence to support the previous data that early genes of AcNPV were transcribed by host RNA polymerease III, while transcription of late genes was mediated at least by a novel $\alpha$-amanitin-resistant RNA polymerase.
Journal of the Society of Cosmetic Scientists of Korea
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v.23
no.3
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pp.9-23
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1997
Retinoids are essential regulators of spithelial cell growth and celluar differentiation. They are also known to be effective in photoaging. It was reported that topical application of retinoic acid improves facial wrinkle carsed by collagen synthesis reduction in photodamaged skin. Collagen synthesis by retinoic acid may contribute to the wrinkle effacement. Since celluar retinoic acid binding protein II is slsctively induced in human skin and dermal fibroblasts in vitro by retinoic acid, this response can be used to mesure retinoids potency and activity. In order to know the activity of retinoids and their relations with collagen synthesis, we treated dermal fibroblasts with retinoids for 48 hours at 10-6-10-7M and measured CRABPII mRNA level by quantitative Nortern blotting. We also measured the rate of collagen systhesis by retinoids using 3-dimensional dermal equivalent. CRABPII mRNA level was increased 3-fold by retinoic acid, 2.1-fold by retinol and 1.4-fold by retinaldehyde. Collagen systhesis was increased 34% by all-trans retinioc acid, 26% by retinol, 17% by retinaldehyde and 7% by retinyl palmitate. From the above results, retinoids were found to be a potent indecers of CRABPII mRNA and collagen synthesis. Though retinoic acid was the most effective, its use has been restricted because of the side effects. Instead, retinol can be a best candidate in cosmetics for the treatment of photodamaged skin in terms of efficacy and safety.
Effects of B(a)P on preimplantation mouse embryos in vitro were studied. Preimplantation mouse embryos were exposed to a concentration of 0.3, 1, 3 and 10 $\mu$M B(a)P for 72 hrs. The toxicological effects of B(a)P were evaluated by morphological observation of embryos up to the blastocyst stage, and by measuring DNA, RNA and protein synthesis by radioactive precursor incorporation. At 1 $\mu$M B(a)P did not affect preimplantation development but interfered with hatching and ICM formation. Suppressing effect of ICM formation was dose dependent. At the eight cell stage, the developmental rate was decreased at above 3 $\mu$M of B(a)P. At the blastocyst stage, attachment and trophoblast outgrowth were diminished at the 10 $\mu$M of B(a)P and ICM formation was decreased at 1 $\mu$M of B(a)P. Inner cell number of blastocyst was decreased dose dependently. So, number of ICM was one of the most sensitive and toxicological end point. The RNA incorporation rate of 0.1 $\mu ^3$H-uridine was dosedependent and the protein incroporation of 0.5 $\mu Ci ^{35}$S-methionine showed a significant decrease after 48 hrs. But the DNA incorporation rate of methyl-$^3$H thymidine was not affected. Our results suggested that B(a)P did not affect the DNA replication but transcription was inhibited by dose dependent manner. There delay of development during the blastocyst stage was mainly due to the inhibition of RNA synthesis followed by protein synthesis.
In vitro selection was used to isolate $Mg^{2+}$-dependent self-cleaving ribozymes with cis-cleavage activity from a pre-tRNA library having 40-mer random sequences attached to 5'-end of E. coli $tRNA^{Phe}$. After 8 rounds of SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), RNA molecules which can self-cleave at the high concentration of $Mg^{2+}$ were isolated. The selected ribozymes can carry out the self-cleavage reaction in the presence of 100 mM $Mg^{2+}$ but not in 10 mM $Mg^{2+}$. The cleavage sites of the ribozymes are located at +3 and +4 of $tRNA^{Phe}$, compared with +1 position of 5'-end cleavage site of pre-tRNA by RNase P. New RNA constructs deprived of its D stem-loop, anticodon stem-loop, variable loop and T stem-loop, respectively showed the cleavage specificity identical to a ribozyme having the intact tRNA structure. Also, the new ribozyme fused with both a ribozyme and $tRNA^{Leu}$ showed the cleavage activities at the various sites within its sequences, different from two sites of position +3 and +4 observed in the ribozyme with $tRNA^{Phe}$. Our results suggest that the selected ribozyme is not structural-specific for tRNA.
Protein synthesis is the ultimate outcome of gene expression which, in turn, is regulated by several translation factors. We attempted to identify substances that can inhibit the translation process in vitro when the outcome protein is luciferase. To this end, we developed a sensitive cell-free protein synthesis assay using luciferase as the reporter. The synthesis of luciferase increased proportionately as mRNA was added to a $15-{\mu}l$reaction medium in concentrations raging from 5 ng to 500 ng. The maximum amount of luciferase was synthesized when the media were incubated at $25^{\circ}C$ for 40 min. The concentration of each compound that inhibited luciferase production by 50% ($IC_{50}$) was calculated. Hygromycin, puromycin, and cycloheximide yielded an $IC_{50}$ of 0.008, 0.8, and $0.7{\mu}g/ml$, respectively. A filtrate of Streptomyces spp. isolates inhibited protein synthesis up to S-fold when added to the in vitro translation assay mixture.
In order to clarify the role of gonadal sex steroids in the synthesis of gonadotropin (GTH) subunits in immature rainbow trout, we examined in vitro and in vivo effects of testosterone (T) on the pituitary mRNA levels of GTH I $\beta$, GTH II$\beta$ and a subunits by Northern blot analysis and on the pituitary content levels of GTH I$\beta$ and GTH II$\beta$by radioimmunoassay (RIA). The mRNA levels of the a subunit in T-treated fish were not changed more dramatically than those in control fish both in vivo and in vitro. Interestingly, the mRNA levels of GTH I$\beta$ in T-treated fish were shown to be slightly lower than those in the control fish under these experimental conditions, but no differences were observed in pituitary GTH I$\beta$ contents. In contrast, the mRNA levels and pituitary contents of GTH II$\beta$ subunit were strongly increased by T both in vivo and in vitro. These results demonstrate that the expressions of GTH I$\beta$ and II$\beta$ subunit genes in immatue rainbow trout pituitary are subjected to differential regulation by T.
Effects of Mori Folium Ethanol Soluble Fraction (MFESF) on mRNA expression of glucose transporters, acetyl-CoA carboxylase (ACC) and leptin were examined in db/db mice. 500 and 1000mg/kg dose for MFESF (designated by SY 500 and SY 1000, respectively) and 5mg/kg dose for acarbose were administered for 6 weeks. Quantitations of glucose transporters (GLUT-2 and GLUT-4), ACC and leptin mRNA were performed by RT-PCR and in vitro transcription with co-amplification of rat ${\beta}$-actin gene as an internal standard. Muscular GLUT-4 mRNA expression in MFESF-treated groups were increased dose dependently. On the other hand, MFESF caused the GLLT-4 and leptin mRNA expressions in adipose tissue to decrease dose dependently, which means that triglyceride synthesis in adipocytes might be decreased and consequently signals adipocytes to inhibit the synthesis and release of leptin. Hepatic ACC mRNA expression in MFESF-treated groups was also decreased. and this may result in lowering of serum triiglyceride level. In contrast, liver GLUT-2 mRNA expressions in MFESF-treated and acarbose groups were increased. Higher rate of glucose uptake into hepatocytes is known to inhibit a phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)-catalyzed reaction, which is a rate-limiting step in gluconeogenesis.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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