• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제34권2호
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• pp.95-106
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• 2007

목 적: 본 연구진은 선행연구를 통하여 생쥐의 미성숙 난자와 성숙 난자 사이에 차이 나게 발현하는 유전자(DEGs)의 목록을 보유하고 있는데, 그 중에서 pentose phosphate pathway (PPP)에 필수적 효소인 Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia)를 선택하여 본 연구를 수행하였다. 난자 성숙 과정에 관련된 Rpia의 기능을 알아보기 위한 기초연구로서 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia의 발현을 비교분석 하였다. 연구방법: 생쥐의 각 조직에서 11개의 MII-selective DEGs의 발현을 RT-PCR방법으로 확인하여 난소에서 강하게 발현하는 4개의 유전자를 선택하였고, 다시 이들 4개 유전자 중 난자에서 높게 발현하는 Rpia를 선택하여 생쥐 및 돼지의 난자, 난구세포, 과립세포에서의 발현을 비교분석 하였다. 돼지 Rpia 염기서열은 밝혀져 있지 않아 EST clustering 기법을 통해 동정하였다. 결 과: EST clustering 기법으로 찾아낸 돼지 Rpia 염기서열은 GenBank에 등록하였고 (Accession Number EF213106), 이를 근거로 primer를 작성하여 RT-PCR을 수행하였다. Rpia 유전자는 생쥐에서는 난자 특이적으로 발현하는 반면 돼지에서는 난자, 난구세포, 과립세포에서 모두 발현하는 차이점을 발견하였다. 결 론: 본 연구는 생쥐와 돼지의 난소에서 Rpia유전자 동정에 대한 첫 보고로서, 본 연구결과로부터 생쥐와 돼지의 COCs는 서로 다른 경로로 포도당의 대사가 일어나는 것을 알 수 있었다. 따라서 이와 같은 차이점이 두 종의 난자를 체외 배양할 때 나타나는 난자 성숙률의 차이를 가져오는 기전 중의 하나가 아닐까 추측된다. 난자 성숙을 조절하는 기전을 연구함과 동시에 체외에서 난자 성숙이 어려운 종의 최적의 IVM (in vitro maturation)조건을 찾기 위해서는 앞으로 난자와 주변세포의 포도당 대사과정에 미치는 Rpia의 기능에 대한 후속연구가 필요할 것으로 사료된다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제18권1호
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• pp.17-21
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• 2005

The effect of melatonin on in vitro embryo development and the expression of antioxidant enzyme gene in preimplantation porcine embryos was determined by modified semi-quantitative single cell RT-PCR. Porcine embryos derived from in vitro maturation /in vitro fertilization were cultured in 5% $CO_2$ and 20% $O_2$ at $37^{\circ}C$ in NCSU23 medium. Melatonin was added to medium at concentration of 1nM, 5 nM, and 10 nM. When treated with 1nM (39.0%) of melatonin, the developmental rate of embryos beyond the morula stage were higher than that of control group (31.0%) (p<0.05). Number of inner cell mass and tropectoderm cell in control (23.0${\pm}$0.5 and 17.3${\pm}$0.8), 1 nM (23.6${\pm}$0.6 and 19.0${\pm}$0.5), and 5 nM (23.3${\pm}$1.1 and 16.3${\pm}$0.8) treated with melatonin were higher than in 10 nM (20.0${\pm}$0.5 and 13.3${\pm}$0.8) treated with melatonin (p<0.05). To develop an mRNA phenotypic map for the expression of catalase, bax and caspase-3, single cell RT-PCR analysis were carried out in porcine IVM/IVF embryo. Catalase was detected in 0, 1 and 5 nM supplemented with melatonin, but bax and caspase-3 were detected in 10 nM treated with melatonin.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제37권4호
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• pp.281-287
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• 2013

In mammal, unfertilized oocytes remain in the oviduct or under in vitro culture, which is called "oocyte aging". This asynchrony negatively affects fertilization in pre- and post-implantation embryo development. Caffeine a phosphodiesterase inhibitor is known to rescue oocyte aging in several species. The objective of this study is to determine the cytoskeleton distribution in aged oocytes and the embryo developmental ability of aged oocytes in the present or absence of caffeine during maturation. Caffeine treatment increased the incidence of normal spindle assembly of aged oocytes (treatment, $67.57{\pm}4.11%$ aging, $44.61{\pm}6.4%$) and no significant differences compared to control group. Fluorescence values were compared using ROS (Reactive oxidation species) stain. Fluorescence values appear of control group intensity rate ($51.53.{\pm}3.80$), aging group ($68.10{\pm}5.54$) and treatment of caffeine ($45.04{\pm}2.98$). Aged oocytes that were derived from addition of caffeine to the IVM (in vitro maturation) medium had significantly increased 2-cell that developed to the blastocyst stage compared to the aging group. Blastocysts, derived from caffeine treatment group, significantly increased the total cell number compare aging ($90.44{\pm}10.18$ VS $67.88{\pm}7.72$). Apoptotic fragments of genomic DNA were measured in individual embryo using TUNEL assay. Blastocyst derived from caffeine treatment group decreased significantly the apoptotic index compared to blastocyst derived from aging group. In conclusion, we inferred that the caffeine treatment during oocyte aging can improve the developmental rate and quality in bovine embryos developing in vitro.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권4호
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• pp.335-343
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• 1997

The effect of thiol compounds on development and intracellular glutathione(GSH) concentrations of bovine embryos produced by in vitro maturation and in vitro fertilization(IVM/IVF) was examined in CRlaa medium with or without $\beta$-mercaptoethanol(0, 10, 25 and 50$\mu$MME) and cysteamine(0, 25, 50 and 75 $\mu$M). Numbers of cells comprising blastocysts were also counted using double fluorescence stain and the total glutathione levels(oxidized and reduced form) of morula and blastocyst embryos were than measured by an enzymatic method. Following routine IVM/IVF procedures oocytes and zygotes were cultured for 40 to 44h in CRlaa medium. Then 2 to 8-cell embyos had cumulus cell removed and were allotted randomly to the experimental medium. In Experiment 1, the proportion of embryos developing to and beyond morulae stages in 0, 10, 25 and 50 $\mu$M $\beta$-ME was 42.9%, 50.0%, 53.7% and 65.6%, respectively. Fifty $\mu$M $\beta$-ME group was significantly higher than those of any other groups (P<0.05). In Experiment 2, the percentages of embryos developed beyond morulae stages in 0, 25, 50 and 75 $\mu$M cysteamine was 42.9%, 40.4%, 60.0% and 59.2%, respectively. Fifty and 75$\mu$M cysteamine groups were significantly higher than in 0 and 25 $\mu$M cysteamine groups, but all of culture medium containing cysteamine(52.6%) was not significantly difference in control group(42.9%). In Experiment 3, the intracellular GSH concentrations of morulae and blastocyst embryos in 0 and 50 $\mu$M $\beta$-ME was 42.4 pM and 44.9 pM, 49.5 pM and 67.8 pM, respectively. Morulae embryos were not difference, but blastocyst embryos were significantly difference between treatments(P<0.05). In Experiment 4, the intracellular GSH concentrations of morulae in CRlaa with or without cysteamine were 39.8 pM and 45.6 pM, and blastocysts were 59.3 pM and 66.8 pM, respectively. Cell numbers of blastocysts were similar to in all experimental groups. These experiments indicate that thiol compounds can increase the proportion of embryos that developing to and beyond morulae stage and the intracellular GSH concentrations.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.375-383
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• 2000

본 연구는 공여난소의 황체 형태가 소 미성숙난자의 체외 성숙과 발생에 미치는 영향을 감수분열과 수정란 생산을 비교하여 조사하였다. 공여난소를 황체의 형태에 따라 다음과 같이 4 group 으로 분류하였다. Group 1 ; 최근에 배란한 흔적으로 보이는 혈포가 있는 난소. Group 2 ; 황체는 적색 또는 갈색이며, 혈관이 황체의 가장자리에 국한되어 분포하고 있는 난소. Group 3 ; 황체는 오렌지 또는 황갈색이며, 혈관이 황체의 정상부 까지 분포한 난소. Group 4 ; 황체는 잃은 황색 또는 백색이며, 황체 정상부의 혈관분포가 사라진 난소. 미성숙난자의 체외성숙과 배발생을 위하여 각각 TCM 199과 TLP-PVA을 기본배지로 사용하였다. 각 group에서 채취한 미성숙 난자를 4, 14, 24시간 체외성숙시켰을 때 metaphase I과 metaphase II에 도달한 난자의 비율은 각 group 사이에 차이가 없었으며, 각 group 에서 metaphaseII난자는 체외성숙 후 14시간에 나타나기 시작하여 24시간에 성숙이 종료하였다. 체외 배발생 후 2세포기와 8세포기까지의 발생에는 공여난소 황체의 형태가 영향을 미치지 않았으나, 상실배와 배반포로 발생한 수정란의 비율은 group 1과 3에서 채취한 난자에서 group 2와 4에서 채란한 난자에 비하여 유의적으로 증가하였다 (p＜0.05). 이러한 결과는 공여난소의 번식상태가 체외 수정란생산에 유의적인 영향을 미치는 것으로 암시하고 있다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제19권4호
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• pp.495-499
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• 2006

In our previous studies, we demonstrated that Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) enhances bovine oocyte maturation and early embryonic development in serum supplemented media. In this experiment, to determine the synergistic effect of VEGF with serum components on early embryonic development in vitro in cattle, 1 mg/ml polyvinyl-alcohol (PVA) was replaced with foetal bovine serum (FBS) in maturation and culture media. Bovine oocytes were matured in Synthetic Oviduct Fluid (SOF) supplemented with PVA, PVA+5 ng/ml of VEGF, FBS, or FBS+VEGF. Fertilized oocytes were cultured in the same conditions for 8 days. The development of embryos was examined at 48 h post- insemination and on days 6, 7 and 8. The results were analyzed using repeated measures two- factor ANOVA, in which the effects of VEGF and serum were assigned as two factors. The development rate to 4- to 8-cell embryos at 48 h was significantly higher in the PVA+VEGF group than in the PVA group (44.7% and 31.5%, respectively). However, the highest development rate to 4- to 8-cell embryos was obtained from the FBS+VEGF group (58.8%). On day 8, the blastocyst rates were higher in the PVA+VEGF (22.8%), FBS (32.1%, p<0.05) and FBS+VEGF (42.1%, p<0.05) groups than in the PVA group (17.1%). Two- factor ANOVA of the development rates indicates that VEGF had a significant effect, but had no synergistic effect with serum components on early embryonic development. The results of the present study demonstrate that VEGF improves the in vitro developmental competence of bovine oocytes and/or embryos independent of the effect of serum components.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권1호
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• pp.59-63
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• 2004

1. The concentrations of Ang. II were 7.20.91 ${\times}$ $10^3$ , 3.80.34 ${\times}$ $10^3$, 3.50.30 ${\times}$ $10^3$, 2.80.22 ${\times}$ $10^3$ pg/ml in bovine follicular fluids from 1∼3 mm, 3∼5 mm, 5∼7 mm and 8∼10 m follicles, respectively. The concentrations of Ang. II decreased in follicular fluids from large follicles. 2. When oocytes were cultured in media containing various concentrations of Ang. II, a higher proportion of oocytes developed to MII stage in medium with 100 ng/ml (79.5%) Ang II compare to that without Ang. II (58.8%). When oocytes from different sizes of follicles were separately cultured in media containing 100 ng/ml Ang. II, maturation rates were higher in oocytes from small and medium follicles those from controls. 3. GSH content in oocytes cultured for 24 hrs in TCM-199 medium containing 10 and 100 ng/ml of Ang. II was also higher than that of oocytes cultured in medium containing 0 or 10 ng/ml Ang. II. When oocytes were cultured in media containing 0, 10, 100, 1,000 ng/ml of Ang. II, the concentrations of GSH were 5.1M, 5.5M, 7.2M, 8.7M, respectively. 4. When oocytes were cultured in media containing various concentrations of 10, 100, 1,000 ng/ml Ang. II, in vitro maturation and developmental rates were 84.0%, 90.0%, 78.0% and 28.0%, 36.0%, 20.0%, respectively. When oocytes were cultured with an addition of Ang. II in media, in vitro maturation rates higher than that of their controls (76.0%).

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제35권4호
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• pp.285-291
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• 2008

목 적: 미성숙 난자의 체외성숙에 있어 난구세포의 양상 및 미성숙 난자의 크기가 영향 인자로 작용하는지를 알아보고자 하였다. 연구방법: 체외수정을 위한 과배란유도 후 난자채취를 시행한 21명의 환자로부터 41개의 난포 단계의 난자를 얻었다. Denudation 이전의 난구세포의 모양에 따라 dispersed 난구세포와 compacted 난구세포로 나누었다. Denudation 이후 투명대를 포함하는 난자외직경 (outer oocyte diameter)과 투명대를 포함하지 않는 난자내직경 (inner oocyte diameter)을 측정하고 체외성숙 배양액에서 체외성숙을 시도하였다. 난자의 성숙은 제1극체가 나온 경우로 정하였다. 성숙이 확인된 난자는 ICSI 방법을 이용하여 수정시키고 다음날 두 개의 전핵이 뚜렷이 보이는 경우에 수정된 것으로 간주하였다. 결 과: 전체적인 체외성숙률은 56.1%, 수정률은 73.9%이었다. Dispersed 난구세포 난자 중에서 성숙된 난자 비율 (91.3%)은 비성숙 난자 비율 (55.6%)보다 유의하게 높았다 (p=0.023). 성숙 또는 비성숙 난자에서 난자외경($155.7{\mu}m$ vs. $152.4{\mu}m$, NS)과 내경 ($114.3{\mu}m$ vs. $113.4{\mu}m$, NS) 및 투명대 두께 ($41.3{\mu}m$ vs. $39.1{\mu}m$, NS)는 차이가 없었다. 체외성숙률은 dispersed 난구세포 난자에서 compacted 난구세포 난자보다 의미있게 높았으나 (67.7% vs. 20.0%, p=0.044), 수정률에 있어 두 군간의 유의미한 차이는 없었다. 난자의 외경, 내경 및 투명대 두께에 따른 체외성숙률 및 수정률의 차이가 없었다. 결 론: Dispersed 난구세포를 가진 미성숙 난자가 compacted 난구세포를 가졌던 난자에 비하여 더 높은 체외수정능을 가진다는 결과는 dispersed 난구세포가 미성숙 난자의 체외성숙 예측을 위한 하나의 지표로 사용될 수 있음을 시사한다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제39권3호
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• pp.89-95
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• 2015

체외 배양액에 성장호르몬 및 사이토카인의 첨가는 초기배 발육 및 생산된 배반포의 질에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구는 돼지 유도만능줄기세포(porcine induced pluripotent stem cell, piPSC)의 조정배지(conditioned medium, CM)가 돼지 난자의 체외성숙 및 단위발생 후 초기배 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 수행하였다. 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complex, COC)는 0(control), 25, or 50%의 줄기세포 배양액(stem cell medium, SM) 또는 CM이 첨가된 체외성숙 배양액으로 배양하였으며, 성숙된 난자는 활성화 유도 후 같은 농도의 SM 또는 CM을 첨가한 체외배양액에서 배양하였다. 체외 성숙율은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 높았으나 (p<0.05), 다른 SM 또는 CM 처리구와는 차이가 없었다. 배반포 형성율은 CM-25% 그룹(29.2%)에서 대조구(20.7%), SM-50%(19.6%) 및 CM-50%(23.66%) 처리구보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포에서의 세포수 및 세포사 비율은 SM-25% 그룹이 대조구에 비하여 유의적인 차이가 나타났다(p<0.05). 난자의 질과 연관되어 있는 유전자들(Oct4, Klf4, Tert 및 Zfp42)의 발현은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 증가되었다(p<0.05). 따라서 본 실험의 결과 체외성숙(IVM) 및 체외발달(IVC) 배양액에 25% 수준의 CM의 첨가는 돼지 단위발생 난자의 배발달과 난자의 질적 향상에 기여하는 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제16권3호
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• pp.163-172
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• 2001

본 연구는 돼지 난포란의 체외성숙에 적합한 배양액을 조사하고, 아울러 산소농도가 돼지 난포란을 이용한 체외수정란의 생산에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. NCSU-23과 TCM-199 배양액에 10% PFF를 첨가하여 5% 및 20% 산소조건하에서 체외성숙을 유기한 결과, 배양액 및 산소조건에 따른 난핵붕괴률 및 핵성숙률에는 유의적 (P>0.05)인 차이가 없었다. 2. NCSU-23이 TCM-199 배양액보다 다정자침입률 및 평균정자침입률에 있어서 유의적으로 낮은 결과를 나타냈고 (P>0.05), 5% 및 20% 산소농도에 따른 차이는 인정되지 않았다. 3. 체외수정을 실시한 후, 5% 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 배달달 2일째 배반포형성에 있어서는 NCSU-23 처리구가 TCM-199 처리구에 비해서 유의적 (P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 또한, 처리구별 배반포기의 총세포수를 조사한 결과 5% 및 20% 산소농도 사이에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 따라서, 효과적으로 돼지 난포란을 이용하여 체외발달을 유기하기 위한 체외성숙조건은 20% 산소조건하의 NCSU-23 배양액이 적합한 것으로 사료된다.