본 연구는 소형견의 불임 해결을 위해 미숙난자를 보존 후 이용할 수 있는지의 여부를 판명하기 위하여 미성숙 난포란을 시간별로 배양한 뒤 vitrification 동결 융해후 체외수정율과 생존율을 조사하였다. 1 미숙난포란을 회수 후 1, 6, 12, 24시간 성숙 배양 후vitrification동결 융해 후 체외수정 시켰을때 수정율은 각각 31.4%. 22.5%, 11.9% 및 5.3%로서 대조군의 수정율 60.0%에 비해 낮은 성적이었고, 회수 후 시간이 경과되지 않은 난포란이 높은 체외수정율을 나타냈다. 2. 미숙난포란을 회수 후 1, 6, 12 및 24시간 배양시킨 난포란을 vitrification 동결 융해 후 체외 수정시킨 배의 생존율은 각각 55.0%, 40.0%, 28.6% 및 17.1%로써 대조군의 76.7%에 비해 낮은 생존율을 나타냈다.
This study was conducted to investigate the effect of vitrification solution(VS) on in vitro developmental competence of immature porcine oocytes. The immature porcine oocytes were exposed to the following vitrification solution, at RT. 1) EFS sol. : 20% ethylene glycol (EG) 3 min, 40% EG + 18%(w/v) Ficoll(MV70, 000) + 0.3 M sucrose 30 sec, 2) GE sol. : 10% glycerol 5 min, 10% G + 20% EG 5 min, 25% G +25% EG 30 sec, 3) EG sol : 1.5M EG 2.5 min, 5.5 M EG + 1.0 M sucrose 30 sec. Oocytes were immediately transferred into 1.0 M, 0.5 M, 0.25 M, 0125 M, 0 M sucrose solution for 2.5 min each at RT. After removal of VS, immature oocytes were matured in vitro and subsequently all oocytes were subjected to IVF followed in vitro culture for 7 days. Maturation rates of oocytes were 38.8%, 44.5%, 22.4% and 57.6%, in EFS, EG, GE and Control, respectively, maturation rates of oocytes in EG and Control was significantly higher than EFS and GE(P<0.01). Fertilization rates of oocytes in Control was significantly higher than other treated groups(P<0.05), but no difference were observed among treated groups. Polyspermic rates were no significant difference among four groups. Cleavage rates of oocytes were 21.9%, 47.1%, 19.0% and 65.9%, in EFS, EG, GE and Control, respectively, cleavage rates of oocytes in EG and Control was significantly higher than EFS and GE(P<0.05), but blastocyst formation rates were no significant difference among four groups. These results suggested that the use of EG solution could be a great challenge for reaching a successful vitrification of immature porcine oocytes.
본 연구는 돼지 난포란의 동결시기를 결정하고자 미성숙, 성숙중, 생숙후의 3 가지 성숙단계의 난포란을 동해방지제에 노출하거나 동결, 융해하여 체외성숙율과 체외발생율을 대조구와 비교 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 추가배양했을 때 난포란의 성숙율은 각각 45.2, 45.0, 50.3%으로 무처리구 55.0% 와 비슷하였다. 2. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양 한 난포란을 동해방지제에 노출한 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 18.6, 19.7, 47.6% 로 0 시간과 24 시간에서는 무처리구 50.9% 보다 유의하게 낮은 배발달율을 나타내었으나 44 시간에서는 차이가 나타나지 않았다. 3. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 추가배양했을 때 난포란의 동결, 융해 후 성숙율은 각각 4.3, 7.1, 46.7%로 무처리구 62.4% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다. 4. 각각 0, 24, 44 시간 동안 성숙배양한 난포란을 일단계 초자화동결법 (one-step vitrification)으로 동결, 융해 후 체외수정하고 배양했을 때 난자의 발달율은 각각 2.5, 2.4, 10.2%로 무처리구 49.6% 보다 유의하게 낮은 성숙율을 나타내었다.
The growing oocytes become progressively capable of resuming meiosis, and full meiotic competence appear when they are about 80% of the size of fully grown oocytes. As hormonal influences vary at different stages of reproductive cycle, the size of oocytes may vary according to the reproductive stages. The present study was designed to compare the diameter between the ovulated and freshly collected immature canine oocytes. The ovulated oocytes were collected 72 hr after ovulation by oviductal tube flushing by laparotomy under general anesthesia. Immature oocytes were collected by ovarian slicing method. Diameter of all oocytes was measured directly using epiflurescence microscope with a calibrated micro-eyepiece micrometer at ${\times}200$ magnification. The thickness of zona pellucida and diameter of cytoplasm were measured separately and recorded. A total of 2209 zona intact oocytes were collected, among them 628 from anestrus, 675 from follicular, 838 from luteal and 68 by fallopian tubes flushing methods. The average number of oocytes was 104.7, 168.8, 119.7 and 11.3 for anestrus, follicular, luteal and fallopian tubes flushing methods, respectively. The average diameters of the ooplasm and oocyte were significantly varied in different reproductive stages as well as with ovulated oocytes (P<0.05). The average diameter of ooplasm and oocyte was 115.6 and 127.7, 143.0 and 162.0, 134.6 and 150.6, 159.6 and 185.6 for anestrus, follicular, luteal and ovulated oocytes, respectively. Highest number of oocytes with larger diameter could be collected from the follicular and luteal stages. In conclusion, the follicular and luteal ovaries are the best sources of oocytes for canine IVM.
Previous studies have shown that BMI-1026 is a potent inhibitor of the cyclin-dependent kinases (cdk). In cell culture, the compound also arrests G2/M strongly and G1/S and S weakly. Two key kinases, cdk1 (p34cdc2 kinase) and mitogen-activated protein (MAP) kinase (erk1 and 2), perform crucial roles during oocyte maturation and, later, metaphase II (MII) arrest. In mammalian oocytes, both kinases are activated gradually around the time of germinal vesicle breakdown (GVBD) and maintain high activity in eggs arrested at metaphase II. In this study, we examined the effects of BMI-1026 on GVBD and MII arrest in mouse oocytes. BMI-1026 inhibited GVBD of immature oocytes and activated MII-arrested oocytes in a concentration-dependent manner, with more than 90% of oocytes exhibiting GVBD inhibition and MII activation at 100 nM This is approximately 500$\sim$1,000 times more potent than the activity reported for the cdk inhibitors roscovitine (${\sim}50{\mu}M$) and butyrolactone (${\sim}100{\mu}M$). Based on the results of previous in vitro kinase assays, we expected BMI-1026 to inhibit only cdk1 activation in oocytes and eggs, not MAP kinase. However, in our cell-based system, it inhibited the activity of both kinases. We also found that the effect of BMI-1026 is reversible. Our results suggest that BMI-1026 inhibits GVBD and activates MII-arrested oocytes efficiently and reversibly and that it also inhibits both cdk1/histone HI kinase and MAP kinase in mouse oocytes.
Objectives: This study was to investigate the fertilization rate after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) or partial zona dissection (PZD) of human and hamster sperm into hamster oocyte in in vitro fertilization (IVF). In addition, the possibility of clinical application was evaluated by the comparison of usefulness and difference of these method. Materials and Methods: Hamster immature oocytes were obtained from oviducts superovulated by PMSG and hCG, and hamster sperms were obtained from epididymis. The freezed human sperms were thawed before use. Fertilization were confirmed by two pronuclei, one pronucleus, swollen sperm head or/and two polar bodies at $7{\sim}8$ hour after ICSI or PZD. Results: The fertilization rates after ICSI and PZD of human sperm to hamster oocyte were 3.6%, 64.2%,73.6%, and 55.6% for negative control, positive control, ICSI, and PZD respectively, suggesting that ICSI only showed improved fertilization rate (p<0.01). The fertilization rates after ICSI and PZD of hamster sperm to hamster oocyte were 11.1%, 51.2%, 39.6%, and 72.7% for negative control, positive control, ICSI, and PZD respectively, suggesting that PZD only showed improved fertilization rate (p<0.01). PZD showed significantly higher fertilization rate than ICSI (p<0.05). Conclusions: As for the fertilization rate by ICSI and PZD using hamster oocyte in IVF, ICSI technique was considered to be more useful for human sperm and PZD technique for hamster sperm. Therefore, ICSI technique was considered more appropriate for experimental application using human sperm and hamster oocyte.
Roy, Pantu Kumar;Fang, Xun;Hassan, Bahia MS;Shin, Sang Tae;Cho, Jong Ki
한국수정란이식학회지
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제32권3호
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pp.111-122
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2017
The objective of this experiment was to explore the effects of Roscovitine (Rosco) prior to in vitro maturation (IVM) of immature pig oocyte. Brilliant cresyl blue test has been used to select the good quality of oocyte. Specifically, the effects of Rosco exposure on nuclear and cytoplasmic maturation, diameter, intracellular glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS), and embryonic development after parthenogenetic activation (PA) and somatic cell nuclear transfer (SCNT), and gene expression levels in SCNT embryos have been measured. Cumulus oocyte complexes (COCs) have been exposed in $75{\mu}M$ of Rosco for 22 and 44 h. The COCs that were matured in the IVM for 44 h without Rosco used as control group. Diameter of matured porcine oocytes 44 h culture with Rosco was significantly lower than 22 h culture with Rosco and control groups. GSH was higher in control group than 22 h and 44 h with Rosco but reduction of ROS in 22 h than 44 h with Rosco. In PA, exposure with Rosco 44 h oocytes group has been significantly lower than 22 h and control group in rates of maturation, cleavage and blastocyst formation. Similarly, in SCNT embryos rates of maturation, cleavage and formation of blastocyst have been also significantly lower in 44 h Rosco treated group than other two groups. SCNT embryos treated with Rosco 22 h showed greater expression levels of POU5F1, DPPA2 and NDP52Il mRNA compared with other two groups. Our results demonstrate that Rosco treatment with 22 h prior to IVM improves the development competence of porcine oocyte.
Lee, Ji Hye;Yoo, Miyoun;Lee, Sang Mee;Park, Soon-Jae;Kil, Tae Young;Kim, Min Kyu
Journal of Animal Science and Technology
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제63권2호
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pp.272-280
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2021
Cumulus-oocyte complexes (COCs), which contain immature oocytes, are matured in vitro for in vitro embryo production. Oocyte and cumulus cells are then separated using hyaluronidase. To date, there have only been a few reported cases of the toxic effects of hyaluronidase on porcine oocytes. The aim of this study was to compare the effects of bovine testis-derived hyaluronidase and recombinant human hyaluronidase on oocyte denudation and quality. Porcine COCs were matured for 44 h and denuded using different hyaluronidase concentrations and exposure times. Then, oocytes were activated by electrical parthenogenesis. In experiment 1, COCs were denuded using bovine-derived, ovine-derived (Hirax), and human recombinant (ALT-BC4) hyaluronidases for 10 and 20 min. In experiment 2, bovine-derived and human recombinant (ALT-BC4 and ICSI Cumulase®) hyaluronidases were used to denude the COCs for 2 and 20 min. In both experiments the oocytes were all completely denuded, and there was no degeneration. Rate of embryo development was significantly increased in group treated ALT-BC4 for 2 min and not significantly different in other treatment groups. In general it slightly decreased with longer exposure times. These results have confirmed that different sources of hyaluronidase do not have detrimental effects on the quality of porcine oocytes and suggest that the human recombinant hyaluronidase ALT-BC4 is suitable for oocyte denudation with an increased blastocyst rate.
This experiment was carried out to determine the possibility of using FDA on the selection of viable bovine immature oocytes. The results obtained in these experiments were summarized as follows; 1. The rates of nuclear maturation (metaphase II) of bovine oocytes according to FDA concentration were 92.5% (37/40) in the control and those rates in the dilution on FDA to 1:400,000, 1:800,000 and 1:1,600,000 were 74.4% (67/90), 80.3% (38/46) and 71.1% (32/45), respectively. 2. The fertilization rate ( 2-cell) in the control was 72.2% (39/54) and those rates in the dilution of FDA to 1:400,000, 1:800,000 and 1:1,600,000 were 28.8% (23/80), 66.7% (32/48) and 62.2% (28/45), respectively. In these results, a, pp.opriate concentration of FDA to bovine immature oocytes was 1:800,000. 3. Effect of FDA treatment to the blastocyst development of bovine oocytes was indicated that control was 22.2% (18/81) and FDA treatment groups which were classified to strong, partial and weak were 21.4% (36/168), 14.5% (9/62) and 0% (0/15), respectively. This result suggested that in vitro development to the blastocyst was severely reduced except strong group according to the FDA fluorescent level (P<0.05) and that using FDA is possible to select of bovine oocytes.
Objective: The aim of this study was to compare the rate of maturation, fertilization, and embryo development of in vitro-matured human oocytes derived from pregnant and non-pregnant women. Methods: Immature oocytes were obtained by needle aspiration from 49 pregnant women (group 1) who underwent a cesarean section at term and 77 non-pregnant women (group 2) who underwent a gynecological operation during the same period (8 months). Healthy immature oocytes (530 in group 1 and 539 in group 2) were cultured and assessed for maturation 36 hours later. Mature oocytes were inseminated by intracytoplasmic sperm injection and cultured up to 144 hours. Results: The percentage of degenerated oocytes was significantly higher (12.1% vs. 6.3%; p<0.001) in group 1 than in group 2. There was no significant difference in the maturation rate (66.8% vs. 68.1%; p=0.698), fertilization rate (66.7% vs. 67.6%; p=0.857), or the rate of formation of good-quality blastocysts (46.2% vs. 47.2%; p=0.898) in oocytes obtained from pregnant and non-pregnant women. Conclusion: The developmental competence of immature oocytes did not differ between pregnant and non-pregnant women.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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