• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제24권1호
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• pp.43-49
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• 1997

본 연구는 단위발생과 체외수정으로 생산된 돼지 난자의 발달양상과 inner cell mass(ICM) 그리고 trophectoderm (TE)의 세포배열을 조사하기 위하여 실시하였다. 단위발생은 ethanol 단독처리(haploid) 혹은 ethanol과 cytochalasin B을 공동처리(diploid)하였던바, 단위발생란은 체외수정란에 비하여 배반포까지의 발달이 저조하였지만, 단위발생에 있어서 ethanol과 cytochalasin B을 공동처리한 군이 ethanol 단독처리한 군보다 배반포까지 발달이 촉진되었다. 또한 단위발생란의 경우 total 세포수와 ICM 수에 있어서 체외수정란에 비하여 현저하게 감소되었지만, ethanol과 cytochalasin B을 공동처리한 단위발생란이 ethanol 처리된 단위발생란보다는 현저하게 높은 total 세포수와 ICM 수가 조사되었다. 이상의 결과로, 돼지의 착상전 배발달 양상과 ICM와 TE의 세포배열에 있어서 ploidy가 영향을 미친다는 것을 알수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.229-237
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• 2004

본 연구에서는 소 체외수정란 생산에 있어서 체외성숙용 배지에 첨가하는 혈청과 호르몬의 효과를 검토하기 위하여 제1극체 출현율과 배발달율을 조사하였고, 생산된 배반포의 품질을 평가하기 위하여 세포수를 검토하였다. 1. 체외성숙용 배지에 혈청 및 성선자극호르몬의 첨가에 따른 한우 난포란의 제1극체 출현율은 비슷한 경향이었다. 배반포까지의 발달율은 혈청 및 성선자극호르몬 공동 첨가군(26.0％)이 대조군과 성선자극호르몬 단독 첨가군보다 유의하게 높았다(P<0.05). 혈청 및 성선자극호르몬 공동 처리군에서 생산된 배반포의 ICM, TE, 총 세포수가 가장 많았으며, ICM 세포는 혈청 첨가로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 2. 체외성숙용 배지에 혈청의 첨가시기에 따른 한우 난포란의 제1극체 출현율은 체외성숙 18시간 동안의 처리군과 체외성숙 9시간째부터 첨가한 처리군이 미첨가군보다 높았으며, 체 외 성숙 후 9시간까지의 처리군보다는 유의하게 높았다(p<0.05). 체외성숙용 배지에 혈청의 첨가시기에 따른 한우 난포란의 배발달율은 전군에서 비슷한 수준이었다. 배반포의 TE와 총세포수는 비슷한 경 향이었으나, ICM 세포수는 체외성숙 18시간 동안 처리군이 혈청 미첨가군보다 유의하게 높았다(p<0.05).

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.68-68
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• 2001

Blastocyst formation, consisting of the inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE), is the first differentiation process during embryonic development in mammals. It has been hypothesized that the proportion of ICM to TE in the blastocyst may be crucial for subsequent developmental competence of early embryos, which it may be expressed as a sensitive indicator for evaluating in vitro systems. In this study ICM/total cell ratio of nuclear transfer (NT) embryos was compared with IVF-derived and in vivo embryos. Somatic cell nuclei obtained from a fetus at Day 40 of gestation were transferred into the enucleated oocyte and then cultured in NCSU 23 medium for 6 days as previously described (Koo et al., Biol. Reprod. 2000; 63:986-992). ICM and TE cells of blastocysts were determined by using a differential staining method (Han et al., Biol. Reprod. 1999; 60:1110-1113). Development rate (9.8$\pm$2.5%, 23/225) to the blastocyst stage of NT embryos was lower than IVF embryos (23.8$\pm$2.7%, 53/223). Thus, a difference was detected in the in vitro developmental rate to blastocyst stage between NT and IVF-derived embryos (P<0.05). In the next experiment, we investigated ICM and TE nuclei to assess the quality of blastocysts that produced by NT, IVF and in vivo, respectively. NT blastocysts (27.6$\pm$8.3) showed a smaller total cell number than IVF-derived (42.6$\pm$17.4) and in vivo embryos (283.9$\pm$103.5) (P<0.05). Ratios of ICM/total cells in NT, IVF and in vivo blastocysts were 15.1$\pm$ 18.6% (n=56), 12.3$\pm$9.2% (n=57) and 30.4$\pm$6.8% (n=40), respectively. Individual blastocysts for the ratio of ICM/total cells were assigned to 3 groups (I; <20%, II; 20 to 40% and III;>40%). As the results, most in vivo blastocysts (97.5%, 39/40) were distributed into group II while most NT (78.6%, 44/56) and IVF-derived blastocysts (82.5%, 47/57) were allocated to group I. Thus, our data show that NT or IVF-derived embryos have aberrant morphology during early development in vitro systems, suggesting that these anomalies may result in developmental failures of the NT embryos to term.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권3호
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• pp.319-326
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• 1996

본 연구는 인간의 체외수정 program으로 부터 생산된 여분의 배반포기 배를 이용하여 현미경에 의한 형태학적 판정과 differential labelling 기법을 이용한 세포 수의 상관관계를 조사하고자 실시하였다. 공시된 인간 배반포기 배는 체외수정 후 5일째에 36명의 환자로부터 76개를 얻어 배반포강의 확대와 투명대 두께의 감소를 기준으로 early (ErB), early expanding (BEB), middle expanding (MEB) 및 expanded blastocyst (EdB)로 구분하였다. 분류된 배반포기 배의 크기와 투명대의 두께를 micrometer로 측정하였을 때, 그 크기는 각각 $148.8-217.6{\mu}m$, $1.2-14.4{\mu}m$로 나타나 같은 배양조건에서 생산된 배아라도 그 차이는 크게 나타났다. Hoechst 염색을 이용하여 배반포기 배의 총 세포수를 조사하였을 때, 체외수정 후 5일째 생산된 배반포기 배는 ErB $(39.1{\pm}3.6)$ 에서 EdB $(89.6{\pm}3.3)$ 로 진행되는 동안 두배에서 세배정도 증가되는 양상을 나타내었다. 또한, differential labelling기법 을 이용한 배반포기 배의 inner cell mass (ICM) 와 trophectoderm (TE) 세포수 조사 결과, 각각 $11.9{\pm}1.8-22.2{\pm}4.3$, $24.5{\pm}3.6-70.0{\pm}7.7$을 나타내어 발달이 진행될수록 ICM과 TE세포수도 증가되는 것을 알 수 있었다. 특히, 형태학적으로 약한 ICM으로 판정된 EdB의 경우 differential labelling 후, 역시 적은 ICM 세포수를 나타내어 형태학적 판정과 세포수간에 밀접한 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 따라서, ICM과 TE를 differential labelling하는 기법은 인간 배반포기 배의 quality를 평가하는데 매우 유용한 기법으로 형태학적인 구분과 병용된다면 인간 배반포기 배 이식 program의 임신율 증진을 위한 배아 선별의 중요한 자료로서 이용될 수 있다는 것을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제27권4호
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• pp.259-264
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• 2012

Solution of glycerol, ethylene glycol, sucrose, dextrose (GESD) and cryotop methods were carried out to investigate the survivability on vitrification of embryos. Embryos cultured in vitro were vitrified by GESD of 10 or 8 step and cryotop methods of 6 step, from cryopreservation step to frozen-thawed and culture step. Survival rate and ICM, TE cells of embryos were investigated after frozen-thawed 24 h. As a results, cryotop method was significantly (p<0.05) higher ($85.76{\pm}5.3$ vs. $66.71{\pm}2.4$, $44.80{\pm}2.1%$) than GESD 10 or 8 step methods on survivability. Also, In ICM cell number, cryotop method was significantly (p<0.05) higher to $45.67{\pm}4.7$ cells than GESD 8 step method. TE cell number was significantly (p<0.05) highest to $111.00{\pm}11.0$ cells in cryotop method. On the other hand, survival rate, TE and total cell number were all the significantly (p<0.05) high, except ICM in GESD 10 step method between GESD 10 step method and GESD 8 step method. In conclusion cryotop method was to be most effective, but it is considered necessary to study vitrification method for step-by-step freezing and thawing process.

• 농업과학연구
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• 제40권4호
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• pp.353-358
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• 2013

To demonstrate that follistatin treatment enhances the efficiency of nuclear transfer (SCNT), cell allocation and preimplantational development were determined in bovine SCNT embryos in the present study. Treatment of activated SCNT embryos with 10 ng/ml follistatin significantly increased the proportion of blastocyst development compared to untreated SCNT embryos. In addition, an increase in trophectoderm (TE) cell numbers and relatively higher proportion of TE cells to total cells were observed, but the number of inner cell mass (ICM) cell and total cell numbers were not changed (P < 0.05). No significant effect of other doses of follistatin was observed for the above endpoints. However, treatment with 1 and 10 ng/ml follistatin reduced the proportion of nuclear transfer blastocysts with an ICM ratio of > 60% relative to untreated nuclear transfer blastocysts at Day 7. No significant effect of follistatin treatment on proportions of nuclear transfer blastocysts with ICM ratio of 20-40% or 40-60% was observed. Taken together, these results suggested that follistatin can be used to increase developmental competence of SCNT embryos in terms of cell allocation, particularly TE cells, during preimplantation stages, subsequently enhancing placentation and birth of live offspring.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권1호
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• pp.29-36
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• 2004

본 연구는 체외에서 한우 난포란의 핵성숙과 그 후의 초기 배발달에 있어서 체외성숙 배지에 아미노산의 첨가가 난포란의 제1극체(PB) 출현율, 배발달율 그리고 배반포의 세포수에 미치는 영향을 검토하였다. 첨가하는 아미노산의 종류와 농도는 각각 MEM 배지의 non-essential amino acids (NEAA)와 BME 배지의 essential amino acids(EAA)는 1, 2, 4배 및 유청중의 lactalbumine hydrolysate(LAH)는 1, 5, 10 mg/$m\ell$이었다. 그 결과 NEAA와 EAA의 경우 PB 출현율은 1배 첨가군이 미첨가군보다 유의하게 높았지만(p＜0.05), 첨가량이 증가할수록 오히려 감소하였다. 그러나 배반포로의 배발달율은 모든 군에서 비슷한 경향이었다. 그리고 배반포의 총 세포수와 총 세포수중 TE 세포수는 2배 처리군이 가장 높았으며, ICM 세포수는 아미노산 첨가량이 증가할수록 많아졌다. 한편 LAH의 경우 PB 출현율은 5mg 첨가군이 가장높았으며, 배반포로의 발달율은 미첨가군과 1 mg 첨가군이 5 mg 첨가군과 10 mg 첨가군보다 각각 유의하게 높았다(p＜0.05). 그리고 배반포의 세포수는 NEAA와 EAA를 이용하였을 경우와 비슷한 경향이었다. 이상의 결과로부터 체외성숙용 배지에 아미노산의 첨가는 생산된 배반포의 품질을 향상시킬 수 있기 때문에 배반포의 체외생산에 이용할 수 있는 새로운 아미노산의 종류 및 농도를 탐색할 필요가 있다고 사료된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권1호
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• pp.35-41
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• 2007

본 연구는 인간 난관액 또는 자궁액 내에 존재하는 에너지원이 생쥐 2-세포기 배의 체외 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. ICR 암 생쥐에 5 IU hCG 주사 후 $46{\sim}50$ 시간에 2-세포기 배를 회수하였다. 회수된 배는 3가지 배양 조건 [대조군: 0 mM Group A: glucose(G) 0.5 mM + pyruvate(P) 0.32 mM + lactate(L) 10.5 mM, Group B: G 3.15 mM + P 0.1 mM + L 5.83 mM]에서 72시간 배양하였다. 배양 24 시간에 상실배 출현율은 group A (72.3%)와 group B (56.6%)가 대조군(34.9%)보다 유의하게 높았다.(p<0.05). 그러나 48시간에 배반포기 배 출현율은 대조군(51.8%)이 group A (39.8%)와 group B (25.9%)보다 유의하게 (p<0.05) 높았다. 72시간에 투명대 부착 ($ZiB,\;41.0{\sim}51.8%$), 투명대 탈출 ($ZeB,\;18.1{\sim}32.5%$) 및 총 배반포기 배 출현율 ($68.7{\sim}73.5%$)은 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. 배반포기 배의 평균 세포수와 ICM 세포수는 group A (70.8, 13.4)와 group B (64.4, 11.8)가 대조군 (53.1, 5.7)보다 유의하게(p<0.05) 많았고, 통계적인 유의차는 없었으나 group A가 group B보다 많은 경향이었다. 총 세포수에 대한 ICM 비율은 group A(22.9%)와 group B(23.7%)가 대조군(14.2%)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 영양배엽(TE) 세포수($34.1{\sim}45.1$)는 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. ICM에 대한 TE 비율(ICM:TE ratio)은 대조군(1:6.0)이 group A(1:3.4)나 group B(1:3.4)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 생쥐 2-세포기 배를 배양하여 72시간까지의 배 발달율을 살펴보면 배양액에 에너지원을 첨가하는 것이 효과적이었으며, 자궁액 농도보다는 난관액 농도로 에너지원을 조절했을 때 배 발생 능력이 높은 경향을 보였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제23권1호
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• pp.25-32
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• 1996

본 연구는 Polynucleotide-specific 형광물질을 이용한 Differential labelling 기법으로 체외수정 후 배양 4일째 생산된 B6CBA Fl 생쥐 배반포의 Total, ICM, Trophectoderm의 세포수를 조사함으로서 생쥐의 착상전 후기 배발달에 대한 기초 자료를 얻고자 실시하였다. 공시 배반포는 과배란처리에 의해 얻어진 난자를 $1{\times}10^6cells/ml$의 정자로 수정시키고, 95시간동안 M16배양액과 $37^{\circ}C$, 5% $CO_2$배양기 내에서 배양하여 배반포강의 확대와 투명대 두께의 감소를 기준으로 early, middle, expanded와 hatching으로 구분하였다. 본 연구에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 1) 체외수정 후 95시간째 배반포 발달율은 86.7%였으며, early, middle, expanded와 hatching으로 16.3%, 18.9%, 10.5%, 40.9% 였다. 2) Bisbenzirnide를 이용한 배반포의 총 세포수는 early, middle, expanded, hatching 각각 $35.6{\pm}10.4$, $49.4{\pm}8.6$, $60.8{\pm}10.7$ 과 $62.7{\pm}13.9$를 얻었다. 3) Polynucleotide-specific형광물질을 이용한 Differential labelling으로 배반포 ICM과 Trophectoderm의 세포수를 early, middle, expanded, hatching으로 나누어 조사한 결과, ICM세포수는 각각 $9.6{\pm}3.0$, $13.6{\pm}3.9$, $16.0{\pm}3.3$, $19.5{\pm}4.6$개 이었고, Trophectoderm세포수는 $30.6{\pm}5.1$, $39.9{\pm}5.8$, $42.2{\pm}8.1$, $43.7{\pm}11.1$ 개로 나타나 ICM과 Trophectoderm 모두 동일하게 발달의 진행정도에 따라 세포수의 증가양상을 나타내었다. 또한, Bisbenzimide와 Differential labelling에서 얻어진 총세포수의 비교에서도 동일하게 발달의 진행정도에 따라 세포수의 증가를 나타내었으며 그와 동시에 세포수도 거의 유사하였다. 이러한 결과로 미루어 볼때, Differential labelling을 이용한 빠르고도 간편한 세포수 계산법은 착상전 후기 배발달을 고찰하는데 유용하며, 배양조건에 따른 Embryo의 Quality를 반영하는 Indicator로서 이용될 수 있다는 것을 시사한다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.20-20
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• 2001

It has been reported that cloning cattle is inefficient. One of the problems was placental abnormality, finally resulting in fetal mortality after transfer of nuclear transfer (NT) bovine embryos. This study was focused on the allocations of embryonic cells to the inner cell mass (ICM) or to the trophectoderm(TE) in NT bovine blastocysts. Somatic cells were derived from a Day 45 fetus of gestation, individually transferred into enucleated oocytes and developed to the blastocyst stage in vitro. Differential staining was used to assess the qualify of blastocysts derived from NT, IVF and in vivo. Development rate of NT embryos to blastocysts (25.0%, 41/164) was similar to that of IVF embryos (28.7%, 49/171). The total cell number of NT blastocysts (101.3$\pm$45.9) was not different compared with that of IVF embryos (107.9$\pm$34.2, P>0.05), but was lower than in vivo embryos (122.5$\pm$21.6, P<0.05). Ratio of ICM/total cells was higher in NT embryos (51.6$\pm$ 18.6%) than in IVF and in vivo embryos (42.3$\pm$ 15.3% and 34.9$\pm$8.9%, respectively) (P<0.05). Most IVF (56.8%, 25/44) and in vivo blastocysts(80.8%, 21/26) was distributed in the proportion of ICM/total cells ranging from 20 to 40% group. However, most NT blastocysts was biased in the 40-60%(34.1%, 15/44) and >60% (31.8%, 14/44) groups. Our findings suggest that placental abnormalities or early fetal losses in the present cloning system may be due to aberrant allocation of NT embryos to the ICM cells.