• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.1-8
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• 2008

배아줄기세포는 다양한 분화 유도 방법을 통해 신경계세포로 분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 보다 더 엄격한 선발조건을 적용함으로써 특정 종류의 신경세포만을 확보할 수도 있게 되었다. 세포사멸연구를 포함한 신경생리학적 연구의 대상으로써 중요한 요건은 이렇게 확보한 배아줄기세포 유래의 신경계세포들이 정상적인 신경생리학적 특성을 갖고 있어야 하며, 동시에 그런 신경생리학적 특성이 체외에서 일정기간 동안 이상 자연적인 세포사멸없이 유지되어야 한다는 것이다. 생쥐 배아줄기세포를 retinoic acid로 처리한 후, astrocytes monolayer 위에서 신경계세포로 분화시키면 장기간 생존이 가능한 다수의 신경계세포를 손쉽게 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 면역세포화학적 방법을 통해 신경세포의 생사를 개별세포 수준에서 추적할 수 있다. 배아줄기세포 유래의 신경계세포는 glutamate agonist들에 대해 수용체 특이적 흥분성 신경독성 반응을 보이며, 이 반응은 신경계세포로의 분화가 진행될수록 더욱 뚜렷해지는 양상을 보인다. 신경계세포의 발생분화, 생존에 관여하는 Neurotrophin, GDNF 계열의 신경계 작용 성장인자들의 수용체가 배아줄기세포 유래의 신경계세포에서 발현되고 있으며, 이들에 의해 신경계세포로의 분화과정에서 세포의 생존능 및 신경독성처리에 대한 세포사멸반응이 조절될 수도 있다. 따라서 배아줄기세포 유래의 신경계세포는 신경세포의 생존과 사멸, 그리고 세포손상으로부터의 보호와 같은 신경약리학적 연구를 위한 중요한 특성을 나타내고 있기에 관련 연구를 위한 새로운 연구시스템이 될 수 있는 것이다. 특히 일반적인 신경세포는 유전적 변형이 어려워 다양한 신경약리학적 연구에 많은 제약을 받아 왔으나, 이제 유전자 변형 배아줄기세포로부터 얻은 신경세포를 활용하여 연구할 수 있게 됨으로써, 보다 복합적인 신경약리학적 기초연구도 가능하게 되었다. 특히 최근 인간 배아줄기세포 유래 신경계세포도 유사한 신경독성 반응을 보이고 있음이 확인됨으로써(Schrattenholz & Klemm, 2007), 이제 배아줄기세포는 신경약리학적 기초 연구만이 아닌, 나아가 대량의 약물 스크리닝과 같은 제약산업에도 활용될 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권1호
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• pp.25-33
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• 2006

목 적: 본 연구에서는 착상전 생쥐 배아에서 분리한 할구를 이용하여 배아줄기세포주를 확립하고 그 효용성과 특성을 살펴보고자 하였다. 연구방법: 생쥐 (C57BL/6J)의 2- 또는 4-세포기 배아에서 투명대를 제거하고 할구를 분리하여 지지세포와 공동배양한 후 할구로부터 형성된 내세포괴를 분리하여 계대배양을 실시하였다. 계대배양 중인 세포주의 특성을 확인하기 위해 alkaline phosphatase 활성도와 표지 인자 및 관련 유전자 발현을 세포면역화학적 염색과 RT-PCR 방법으로 살펴보았다. 또한, 계대배양 중인 배아줄기 세포주의 염색체 분석을 실시하였다. 결 과: 전체적으로 2-세포기에서 분리한 할구와 4-세포기에서 분리한 할구에서 각각 3.0% (1/33)와 4.0% (1/25)의 효율로 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 이는 4-세포기의 배아를 사용하였을 때의 16.7% (5/30)에 비해 현저하게 낮았다. 분리된 할구로부터 확립된 배아줄기세포주에서 SSEA-l 과 Oct-4의 발현을 관찰하였고, 이들에서 분화된 배아체에서 삼배엽성 분화 관련 유전자들의 발현도 확인할 수 있었다. 결 론: 본 연구에서는 동물모델을 이용하여 착상전 초기 배아에서 분리한 할구를 이용하여 배이줄기세포를 확립할 수 있음을 확인하였다. 지속적인 관련 연구를 통해 인간의 체외수정 및 배아이식술에서 배아의 파괴 또는 발생 능력에 손상을 주지 않고 새로운 인간 배아줄기세포주를 생산할 수 있는 방법을 개발하고 실용화할 수 있을 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제19권4호
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• pp.549-552
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• 2009

유전자의 융합으로 인한 돌연변이는 염색체 재배열, 트랜스 스플라이싱, 유전자간 스플라이싱으로 인하여 야기된다고 알려져 있다. 우리는 두 개의 서로 다른 유전자의 pre-mRNA의 융합으로 인하여 만들어지는 트랜스 스플라이싱의 전사 산물에 관심을 가져, 인간의 태아 줄기 세포에서 이러한 돌연변이 양상을 분석하였다. 배아줄기세포의 mRNA에서 트랜스 스플라이싱 전사체 70개를 탐지해 내고, 이들의 융합되는 패턴에 따라 5'UTR-5'UTR, 5'UTR-3'UTR, 3'UTR-3'UTR, 5'UTR- CDS, 3'UTR-CDS, CDS-CDS의 6개의 유형으로 분류하여 분석하였다. 두 유전자의 융합되는 영역은 UTR영역보다 CDS에서 풍부하였는데, 이러한 이유는 많은 인트론 수로 인해 야기되는 것으로 추정된다. 융합되는 유전자의 염색체상의 위치분석 결과, 17번과 19번 염색체가 융합유전자의 활성화를 나타내었다. 이러한 연구결과는 향후 융합유전자와 인간의 질병 연구에 크게 기여할 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제14권2호
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• pp.123-129
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• 2010

배아 줄기세포는 미분화상태에서 자가 재생을 유지할 수 있다. 자가 재생은 OCT4, SOX2와 NANOG와 같은 많은 인자들이 작용한다. 생쥐 배아 줄기세포에서 OCT4와 SOX2가 Nanog 프로모터에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실은 생쥐 promoter에 관한 정밀분석으로 알려져 있다. 본 연구에서는 인간 Nanog promoter를 정밀 분석하기 위해 연속적인 결손 돌연변이를 가진 promoter-reporter construct를 제조하였다. Promoter의 최대 활성은 0.6 kb(-253/+365) promoter-reporter construct에서 발견되었으며, 이 construct에는 OCT4 및 SOX2의 결합부위가 포함된다. OCT4와 SOX2의 기여도를 확인하기 위하여 OCT4 및 SOX2의 결합부위에 자리 특이적 돌연변이를 유도하고 promoter 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, OCT4나 SOX2 어느 한 군데라도 돌연변이가 존재하면 promoter 활성이 현저히 저해되었다. 본 연구 결과를 통해 인간 Nanog 유전자 발현에 있어 OCT4 및 SOX2가 필수적임을 직접적으로 확인할 수 있었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제31권3호
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• pp.449-456
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• 2018

Objective: Nanog, a homeodomain protein, has been investigated in humans and mice using embryonic stem cells (ESCs). Because of the limited availability of ESCs, few studies have reported the function and role of Nanog in porcine ESCs. Therefore, in this study, we investigated the location of the porcine Nanog chromosome and its basal promoter activity, which might have potential applications in development of ESCs specific marker as well as understanding its operating systems in the porcine. Methods: To characterize the porcine Nanog promoter, the 5'-flanking region of Nanog was isolated from cells of mini-pig ears. BLAST database search showed that there are two porcine Nanog genomic loci, chromosome 1 and 5, both of which contain an exon with a start codon. Deletion mutants from the 5'-flanking region of both loci were measured using the Dual-Luciferase Reporter Assay System, and a fluorescence marker, green fluorescence protein. Results: Promoter activity was detected in the sequences of chromosome 5, but not in those of chromosome 1. We identified the sequences from -99 to +194 that possessed promoter activity and contained transcription factor binding sites from deletion fragment analysis. Among the transcription factor binding sites, a Sp1 was found to play a crucial role in basal promoter activity, and point mutation of this site abolished its activity, confirming its role in promoter activity. Furthermore, gel shift analysis and chromatin immunoprecipitation analysis confirmed that Sp1 transcription factor binds to the Sp1 binding site in the porcine Nanog promoter. Taken together, these results show that Sp1 transcription factor is an essential element for porcine Nanog basal activity the same as in human and mouse. Conclusion: We showed that the porcine Nanog gene is located on porcine chromosome 5 and its basal transcriptional activity is controlled by Sp1 transcription factor.

• Laboraroty Animal Research
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• 제34권4호
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• pp.257-263
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• 2018

Trefoil factor 1 (TFF1, also known as pS2) is strongly expressed in the gastrointestinal mucosa and plays a critical role in the differentiation of gastric glands. Since approximately 50% of all human gastric cancers are associated with decreased TFF1 expression, it is considered a tumor suppressor gene. Tff1 deficiency in mice results in histological changes in the antral and pyloric gastric mucosa, with severe hyperplasia and dysplasia of epithelial cells, resulting in the development of antropyloric adenoma. Here, we generated Tff1-knockout (KO) mice, without a neomycin resistant ($Neo^R$) cassette, using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9 (CRSIPR/Cas9) system. Though our Tff1-KO mice showed phenotypes very similar to the previous embryonic stem (ES)-cell-based KO mice, they differed from the previous reports in that a reduction in body weight was observed in males. These results demonstrate that these newly established Tff1-KO mice are useful tools for investigating genetic and environmental factors influencing gastric cancer, without the effects of artificial gene insertion. Furthermore, these findings suggest a novel hypothesis that Tff1 expression influences gender differences.

• 한국가금학회지
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• 제36권2호
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• pp.177-186
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• 2009

형질전환 동물에 있어서 외래 유전자의 조절되지 않은 과다 발현은 생리적인 부작용이나 독성을 나타내게 된다. 본 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위하여 외래 유전자 발현 조절 system인 tetracycline-inducible expression system(Tet system)을 도입하였다. 그러나 종래의 Tet system을 이용한 유전자 발현 조절은 system 자체의 구성 요소로 인한 미미한 leaky 현상 때문에 완벽하게 이루어지지 않는다. 본 연구에서는 보다 완벽한 외래 유전자의 발현 조절 system을 구축하기 위하여 rtTA 대신 진일보한 형태의 $rtTA2^SM2$를 도입하고 TRE 부분을 TRE-tight로 대체하였다. 확립된 retrovirus vector system을 이용하여 다양한 표적세포와 형질전환 닭으로부터 혈소판 생산의 일차적인 조절자이며, 조혈간세포의 생존과 증식에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 human thrombopoietin(hTPO)를 생산하고자 하였다. In vitro 상의 연구에서, CEF 세포에서 발현되는 hTPO가 가장 높은 발현량과 발현 유도율을 나타내었으며, 상업적으로 판매되고 있는 hTPO나 다른 표적세포에서 생산된 hTPO에 비해 생물학적 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 고농도로 농축한 재조합 retrovirus를 stage X단계의 계란의 배반엽 층에 미세주입하여 대리 난각 방법으로 배양한 결과, 미세주입한 138개의 계란 중 21일 후에 15개의 계란에서 병아리가 부화하였으며, 그 중 8마리가 형질전환 개체로 확인되었다. 이 형질전환 닭은 사료 1 g 당 0.5 mg의 doxycycline을 첨가하여 2주간 식이하였으며, 그 후 혈액을 채취하여 hTPO 농도를 측정한 결과 200ng/mL로 확인되었다. 또한 형질전환 개체 중 수컷의 정자에서 hTPO 유전자의 존재를 확인함으로써 germLine transmission의 가능성을 입증하였다. 이상의 연구 결과는 사람의 cytokine 단백질의 대량생산을 위한 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산 가능성을 제시한 데 의의가 있다.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제16권16호
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• pp.6813-6823
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• 2015

Glioblastoma, also known as glioblastoma multiforme (GBM), is the most aggressive of human brain tumors and has a stunning progression with a mean survival of one year from the date of diagnosis. High cell proliferation, angiogenesis and/or necrosis are histopathological features of this cancer, which has no efficient curative therapy. This aggressiveness is associated with particular heterogeneity of the tumor featuring multiple genetic and epigenetic alterations, but also with implications of aberrant signaling driven by growth factors. The transforming growth factor ${\beta}$ ($TGF{\beta}$) superfamily is a large group of structurally related proteins including $TGF{\beta}$ subfamily members Nodal, Activin, Lefty, bone morphogenetic proteins (BMPs) and growth and differentiation factor (GDF). It is involved in important biological functions including morphogenesis, embryonic development, adult stem cell differentiation, immune regulation, wound healing and inflammation. This superfamily is also considered to impact on cancer biology including that of GBM, with various effects depending on the member. The $TGF{\beta}$ subfamily, in particular, is overexpressed in some GBM types which exhibit aggressive phenotypes. This subfamily impairs anti-cancer immune responses in several ways, including immune cells inhibition and major histocompatibility (MHC) class I and II abolishment. It promotes GBM angiogenesis by inducing angiogenic factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), plasminogen activator inhibitor (PAI-I) and insulinlike growth factor-binding protein 7 (IGFBP7), contributes to GBM progression by inducing metalloproteinases (MMPs), "pro-neoplastic" integrins (${\alpha}v{\beta}3$, ${\alpha}5{\beta}1$) and GBM initiating cells (GICs) as well as inducing a GBM mesenchymal phenotype. Equally, Nodal promotes GICs, induces cancer metabolic switch and supports GBM cell proliferation, but is negatively regulated by Lefty. Activin promotes GBM cell proliferation while GDF yields immune-escape function. On the other hand, BMPs target GICS and induce differentiation and sensitivity to chemotherapy. This multifaceted involvement of this superfamily in GBM necessitates different strategies in anti-cancer therapy. While suppressing the $TGF{\beta}$ subfamily yields advantageous results, enhancing BMPs production is also beneficial.