NHERF ($Na^+/H^+$ exchanger regulatory factor) and E3KARP (NHE3 kinase A regulatory protein) play important roles in membrane targeting, trafficking and sorting of ion channels, transmembrane receptors and signaling proteins in many tissues. Each of these proteins contains two PDZ (PSD-95/Dlg-1/ZO-1) domains, which mediate the assembly of transmembrane and cytosolic proteins into functional signal transduction complexes. The interaction between NHERF and E3KARP was investigated by surface plasmon resonance spectroscopy (BIAcore), fluorescence measurement, His-tagged pull-down experiment, and size-exclusion column (SEC) chromatography. BIAcore experiments revealed that NHERF bound to E3KARP with an apparent $K_D$ of 7 nM. Fluorescence emission spectra of the NHERF-E3KARP complex suggested that the tight interaction between these proteins was accompanied by significant conformational changes in one or both. The CD spectra of NHERF and E3KARP show that the conformational changes of these proteins were dependent on pH and temperature. These results implicate that the NHERF-E3KARP complex allows intracellular signaling complexes to form through PDZ-PDZ interactions.
Rambhatla, Prashanthi;Kumar, Sanath;Floyd, Jared T.;Varela, Manuel F.
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
v.21
no.9
/
pp.914-920
/
2011
Vibrio cholerae utilizes mannitol through an operon of the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase (PTS) type. A gene, mtlD, encoding mannitol-1-phosphate dehydrogenase was identified within the 3.9 kb mannitol operon of V. cholerae. The mtlD gene was cloned from V. cholerae O395, and the recombinant enzyme was functionally expressed in E. coli as a $6{\times}$His-tagged protein and purified to homogeneity. The recombinant protein is a monomer with a molecular mass of 42.35 kDa. The purified recombinant MtlD reduced fructose 6-phosphate (F6P) using NADH as a cofactor with a $K_m$ of $1.54{\pm}0.1$ mM and $V_{max}$ of $320.8{\pm}7.81\;{\mu}mol$/min/mg protein. The pH and temperature optima for F6P reduction were determined to be 7.5 and $37^{\circ}C$, respectively. Using quantitative real-time PCR analysis, mtlD was found to be constitutively expressed in V. cholerae, but the expression was up-regulated when grown in the presence of mannitol. The MtlD expression levels were not significantly different between V. cholerae O1 and non-O1 strains.
An agar-degrading Agarivorans sp. AG17 strain was isolated from the red seaweed Grateloupia filicina collected from Jeju Island. A beta-agarase gene from Agarivorans sp. AG17 was cloned and designated as agrA. agrA has a 2,985 bp coding region encoding 995 amino acids and was classified into the glycoside hydrolase family (GHF)-50. Predicted molecular mass of the mature protein was 105 kDa. His-tagged agrA was overexpressed in Escherichia coli and purified as a fusion protein. The enzyme showed 158.8 unit/mg specific activity (optimum temperature at $65^{\circ}C$ and pH 5.5 in acetate buffer) with unique biochemical properties (high thermal and pH stabilities). Enzyme produced neoagarohexaose, neoagarotetraose and neoagarobiose by degrading agar, and hydrolyzed neoagaro-oligosaccharides were biologically active. Hence the purified enzyme has potential for use in industrial applications such as the development of cosmetics and pharmaceuticals.
Kim, Jin Ha;Yoo, Ha Na;Bae, Eun Hye;Jung, Yong-Tae
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
v.22
no.12
/
pp.1776-1781
/
2012
Multiple viruses such as Lily symptomless virus (LSV), Lily mottle virus (LMoV), and cucumber mosaic virus (CMV) are the most prevalent viruses infecting lilies in Korea. Leaf samples and bulbs showing characteristic symptoms of virus infection were collected from Gangwon, Chungnam, and Jeju provinces of Korea in 2008-2011. Coat protein (CP) genes of LSV and LMoV were amplified from collected samples by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into a pET21d(+) expression vector to generate recombinant CPs. The resulting carboxy-terminal His-tagged CPs were expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3) by isopropyl-1-thio-${\beta}$-D-galactoside induction. The recombinant proteins were purified using Ni-NTA agarose beads, and the purified proteins were used as an immunogen to produce polyclonal antibodies in rabbits. The resulting polyclonal antisera recognized specifically LSV and LMoV from infected plant tissues in Western blotting assays. Indirect enzymelinked immunosorbent assay and immunocapture RT-PCR using these polyclonal antisera were developed for the sensitive, efficient, economic, and rapid detection of Lily viruses. These results suggest that large-scale bulb tests and economic detection of Lily viruses in epidemiological studies can be performed routinely using these polyclonal antisera.
Sequence analysis of the metabolically rich genome of Streptomyces peucetius ATCC 27952 revealed a 2,199 bp sesquiterpene alcohol (germacradienol) synthase-encoding gene from the germacradienol synthase/terpene cyclase gene cluster. The gene was named spterp13, and its putative function is as a germacradienol synthase/terpene cyclase. The amino acid sequence of Spterp13 shows 66% identity with SAV2163 (GeoA) from S. avermitilis MA4680 and 65% identity with SCO6073 from S. coelicolor A3(2), which produces germacradienol/geosmin. The full-length recombinant protein was heterologously expressed as a his-tagged fusion protein in Escherichia coli, purified, and shown to catalyze the $Mg^{2+}$-dependent conversion of farnesyl diphosphate to the germacradienol, which was verified by gas chromatography/mass spectrometry.
Glycosyltransferase (GT)-specific degenerate PCR screening followed by in silico sequence analyses of the target clone was used to isolate a member of family1 GT-encoding genes from the established fosmid libraries of soil actinomycetes Micromonospora echinospora ATCC 27932. A recombinant MeUGT1 was heterologously expressed as a His-tagged protein in E. coli, and its enzymatic reaction with semi-synthetic phenoxodiol isoflavene (as a glycosyl acceptor) and uridine diphosphate-glucose (as a glycosyl donor) created two different glycol-attached products, thus revealing that MeUGT1 functions as an isoflavonoid glycosyltransferase with regional flexibility. Chromatographic separation of product glycosides followed by the instrumental analyses, clearly confirmed these previously unprecedented glycosides as phenoxodiol-4'-α-O-glucoside and phenoxodiol-7-α-O-glucoside, respectively. The antioxidant activities of the above glycosides are almost the same as that of parental phenoxodiol, whereas their anti-proliferative activities are all superior to that of cisplatin (the most common platinum chemotherapy drug) against two human carcinoma cells, ovarian SKOV-3 and prostate DU-145. In addition, they are more water-soluble than their parental aglycone, as well as remaining intractable to the simulated in vitro digestion test, hence demonstrating the pharmacological potential for the enhanced bio-accessibility of phenoxodiol glycosides. This is the first report on the microbial enzymatic biosynthesis of phenoxodiol glucosides.
Kim, Sung-Jae;Kim, Hae-Min;Choi, Hoon;Kim, Young-Jun
Journal of Life Science
/
v.21
no.7
/
pp.1032-1038
/
2011
Recently identified Ciona intestinalis voltage sensor-containing phosphatase (Ci-VSP) consists of an ion channel-like transmembrane domain (VSD) and a phosphatase-like domain. Ci-VSP senses the change of membrane potential by its VSD and works as a phosphoinositide phosphatase by its phosphatase domain. In this study, we present the construction of His-tagged phosphatase-like domain of Ci-VSP, its recombinant expression and purification, and its enzymatic activity behavior in order to examine the biochemical behavior of phosphatase domain of Ci-VSP without interference. We found that Ci-VSP(248-576)-His can be eluted with an elution buffer containing 25 mM NaCl and 100 mM imidazole during His-tag purification. In addition, we found the proper measurement condition for kinetics study of Ci-VSP(248-576)-His against p-nitrophenyl phosphate (pNPP). We measured the kinetic constant of Ci-VSP(248-576)-His at $37^{\circ}C$, pH 5.0 or 5.5, under 30 min of reaction time, and less than $2.0\;{\mu}g$ of protein amount. With these conditions, we acquired that Ci-VSP(248-576)-His has $K_m$ of $354{\pm}0.143\;{\mu}M$, $V_{max}$ of $0.0607{\pm}0.0137\;{\mu}mol$/min/mg and $k_{cat}$ of $0.359{\pm}0.009751\;min^{-1}$ for pNPP dephosphorylation. Therefore, we produced a pure form of Ci-VSP(248-576)-His, and this showed a higher activity against pNPP. This purified protein will provide the road to a structural investigation on an interesting protein, Ci-VSP.
U, Seong-Gyun;Baek, Seong-Hui;Sin, Dong-Hun;Kim, Hye-Seon;Yu, Yeong-Jun;Jo, Jung-Myeong;Gang, Man-Sik;Jeong, Jin-Ha
Animal cells and systems
/
v.1
no.2
/
pp.323-328
/
1997
We have previously shown that chick muscle extracts contained at least 10 different ubiquitin C-terminal hydrolases (UCHs). In the present studies, one of the enzymes, called UCH-9, was purified by conventional chromatographic procedures using $^{125}l$-labeled ubiquitin-${\alpha}$NH-MHISPPEPESEEEEE HYC (Ub-PESTc) as a substrate. The purified enzyme behaved as a 27-kDa protein under both denaturing and nondenaturing conditions, suggesting that it consists of a single polypeptide chain. It was maximally active at pHs between 7 and 8.5, but showed little or no activity at pH below 6 and above 10. Lice other UCHs, its activity was strongly inhibited by sulfhydryl blocking reagents, such as iodoacetamide, and by Ub-aldehyde. In addition to Ub-PESTc, UCH-9 hydrolyzed Ub-aNH-protein extensions, including Ub-${\alpha}NH$-carboxyl extension protein of 80 amino acids and Ubo-${\alpha}NH$-dihydrofolate reductase. However, this enzyme was not capable of generating free Ub from mono-Ub-${\varepsilon}NH$-protein conjugates and from branched poly-Ub chains that are ligated to proteins through ${\varepsilon}NH$-isopeptide bonds. This enzyme neither could hydrolyze poly-His-tagged di-Ub. These results suggest that UCH-9 may play an important role in production of free Ub and ribosomal proteins from their conjugates.
Park, Jae-Yong;Lee, Kang-Wook;Lee, Ae-Ran;Jeong, Woo-Ju;Chun, Ji-Yeon;Lee, Jong-Hoon;Kim, Jeong-Hwan
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
v.18
no.4
/
pp.746-753
/
2008
The hprK gene encoding bifunctional HPrK/P (kinase/phosphorylase) was cloned from L. mesenteroides SY1, a strain isolated from kimchi. hprK was transcribed as a monocistronic gene. His-tagged HPrH16A and HPrK/P were produced in E. coli BL21 (DE3) using pET26b(+) and purified. HPrK/P phosphorylation assay with purified proteins showed that the kinase activity of HPrK/P increased at slightly acidic pHs. Divalent cations such as $Mg^{2+}$ and $Mn^{2+}$ and glycolytic intermediates such as fructose-1, 6-bisphosphate (FBP) and phosphoenolpyruvate (PEP) increased the kinase activity of HPrK/P, but inorganic phosphate strongly inhibited it. Kinetic studies for the kinase activity of HPrK/P showed that the apparent $K_m$ values were 0.18 and $14.57{\mu}M$ for ATP and HPr, respectively. The $K_m$ value for the phosphorylase activity of HPrK/P was $14.16{\mu}M$ for P-Ser-HPr (HPr phosphorylated at the serine residue).
The cephabacins produced by Lysobacter lactamgenus are ${\beta}$-lactam antibiotics composed of a cephem nucleus, an acetate residue, and an oligopeptide side chain. In order to understand the precise implication of the polyketide synthase (PKS) module in the biosynthesis of cephabacin, the genes for its core domains, ${\beta}$-ketoacyl synthase (KS), acyltransferase (AT), and acyl carrier protein (ACP), were amplified and cloned into the pET-32b(+) expression vector. The sfp gene encoding a protein that can modify apo-ACP to its active holo-form was also amplified. The recombinant KS, AT, apo-ACP, and Sfp overproduced in the form of $His_6$-tagged fusion proteins in E. coli BL21(DE3) were purified by nickel-affinity chromatography. Formation of stable peptidyl-S-KS was observed by in vitro acylation of the KS domain with the substrate [L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-$^3H$-Arg] tetrapeptide-S-N-acetylcysteamine, which is the evidence for the selective recognition of tetrapeptide produced by nonribosomal peptide synthetase (NRPS) in the NRPS/PKS hybrid. In order to confirm whether malonyl CoA is the extender unit for acetylation of the peptidyl moiety, the AT domain, ACP domain, and Sfp protein were treated with $^{14}C$-malonyl-CoA. The results clearly show that the AT domain is able to recognize the extender unit and decarboxylatively acetylated for the elongation of the tetrapeptide. However, the transfer of the activated acetyl group to the ACP domain was not observed, probably attributed to the improper capability of Sfp to activate apo-ACP to the holo-ACP form.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.