• 농업과학연구
• /
• 제25권1호
• /
• pp.79-88
• /
• 1998

본 연구는 축협중앙회 한우개량부에서 사육중인 한우의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출하여 한우의 면역체계에 중요한 역할을 담당하고 있는 BoLA DRB3 exon2 유전자를 PCR기법을 이용하여 증폭하고 친자확인을 위한 이들 대립유전자들의 염기서열을 분석하여 한우의 효율적인 육종에 분자유전수준에서의 접목을 위한 기초자료를 얻고자 실시하였던바, 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1 한우의 혈액에서 추출된 genomic DNA를 1.5% agarose gel에서 전기영동한 결과, 12.2kb이상의 단일밴드로 나타나, genomic DNA는 아주 잘 분리된 것으로 판단되었으며, 한편 genomic DNA로부터 PCR기법을 이용하여 BoLA DRB3 exon2 유전자를 증폭한 결과 284kb의 단편이 증폭 되었음을 확인하였다. 2. PCR 증폭산물을 pCR 2.1 vector를 사용하여 cloning 하고, 균주에 형질전환을 시켜 재조합 plasmid를 추출한 후, EcoR 1으로 처리한 결과 300bp 단편이 확인되어 증폭되어진 BoLA DRB3 exon2 유전자가 vector 내에 잘 삽입되었음을 확인하였다. 3. 부와 모의 BoLA DRB3 exon2 대립유전자의 염기서열을 분석한 결과 염기서열의 상동성은 부의 대립유전자간에는 82.0% 이었고, 모의 대립유전자간에는 90.1%이었다. 4. 친자를 확인하기 위해 부와 모 그리고 자손간의 가계에 대한 BoLA DRB3 exon2 대립유전자의 염기서열을 분석한 결과 Mendel 의 법칙에 따라 유전된다는 사실을 확인 할 수 있었다. 5. 이상의 결과를 종합하여보면 한우의 BoLA DRB3 exon2 유전자의 부와 모, 그리고 자손의 대립유전자에 대한 염기서열 수준에서의 친자확인이 가능하였으며, 이들 연구결과는 축우의 유전적 능력개량에 중요한 분자유전학적 기초 자료가 될 것으로 판단되었다.

• 대한임상검사과학회지
• /
• 제39권2호
• /
• pp.113-121
• /
• 2007

선천성난청은 비교적 흔한(1/1,000) 유전성질환으로 여러 유전자와 관련이 있으며, 최근에는 connexin 26 단백질내의 GJB2 유전자 돌연변이와의 관련성이 보고되고 있다. 유전질환을 예측하기 위한 유전자선별검사를 임상에 적용하기 위해서는 각 해당 국가별로 정상인에서 유전자돌연변이의 빈도를 구하고, 환자의 결과를 비교하여 활용성을 검토한 후 사용하여야 한다. 본 연구에서는 청력검사(TEOAE)가 정상인 신생아에서 GJB2 유전자 돌연변이 빈도를 구하여 screening test를 위한 한국인의 database를 수립하고자 하였다. 검체로는 437 명의 건강한 신생아의 발꿈치를 천자하여 얻은 혈액을 이용하였고, DNA는 Intron 사의 킷트를 사용하여 추출하였으며, GJB2 PCR을 실시한 후 증폭산물(783 bps)은 2% agarose gel로 전기영동을 실시하였고, DNA 자동염기서열분석기를 이용하여 분석을 실시하였다. 총 437명의 한국인 신생아에서 GJB2 유전자 중 8곳의 돌연변이(35delG, 167delT, 235delC, V27I, V37I, M34T, E114G, I203T)를 분석하였으며, 이 중 5곳에서 돌연변이가 발견되었다. 총 437명 중 301명(68.9%)에서 GJB2 유전자돌연변이가 발견되었는데, 그 중 154명이 단일돌연변이였다. V27I 변이가 271명으로 가장 많이 발견되었으며, 대부분의 V27I 변이는 E114G 변이와 함께 나타났다. E114G 변이는 총 146명, I203T 변이는 17명, V37I 변이는 14명, 235delC 변이는 1명의 순으로 나타났다. 이중돌연변이의 대부분은 V27I/E114G였으며, V27I/I203T는 3명에서 나타났고, 삼중돌연변이 V27I/E114G/I203T는 1명에서 발견되었다. 본 연구결과, PCR을 이용한 자동염기분석검사는 GJB2 유전자의 돌연변이 검출에 매우 유용하며, 본 결과는 향 후 신생아 난청선별검사를 위한 한국인의 database로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제30권5호
• /
• pp.1214-1221
• /
• 1998

지질 산화에 의해 생성하는 MDA (malondialdehyde)를 thiobarbituric acid와 반응시켜 측정한 MDA 값은 곰취 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하므로서 추출물들에 의해 산화가 억제됨을 알 수 있었다. 메탄올 추출물의 경우 $15\;{\mu}g/mL$농도로 첨가시 71.7% (13.36 nmol/㎎)의 산화억제율을 나타내었으며 분획물의 경우 ethyl acetate 분획물이 동일농도에서 97% (1.35 nmol/mg)의 억제율을 나타내었다. 산화시간에 따른 MDA 값의 변화는 $25\;{\mu}g/mL$의 농도를 첨가시 에탄올, 메탄올 및 물 추출물의 경우 4시간까지 산화를 억제하였으며 분획물의 경우에는 $20\;{\mu}g/mL$의 농도를 첨가시 ethyl acetate 분획물이 8시간까지 강한 항산화효과를 나타내었다. Agarose gel electrophoresis에서는 에탄올, 메탄올 그리고 물 추출물 모두 항산화 효과가 인정되었다. 지질산화에 의해 생성되는 conjugated diene은 곰취 추출물의 경우 $Cu^{2+}$로 산화시켰을 때 대조에 비해 약 1.1배에서 2.8배까지 감소시키는 효과를 나타내었고 분획물의 경우 약 2.2배에서 3.2배까지의 감소효과를 나타냄으로서 강한 산화 억제효과를 나타내었다. SDS-PAGE를 이용하여 LDL내부에 존재하는 apo B-100부분에 대하여 산화에 따른 분해정도를 측정한 결과 에탄올, 메탄올 및 물 추출물이 천연 LDL의 band와 유사한 band를 나타내었다. Densitometer를 이용한 apo B-100함량은 천연 LDL의 함량을 100%로 하였을 때 에탄올, 메탄올 및 물 추출물의 경우 각각 77.8, 92.5 그리고 82.3%의 함량을 나타내었다. 분획물의 경우 헥산, ethyl acetate 및 물 분획물에서 각각 38.8, 94.5% 그리고 65.5%의 함량을 나타냄으로서 ethyl acetate 분획물이 강하게 산화를 억제함으로서 apo B-100의 분해를 막아주고 있음을 알 수 있었다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제27권5호
• /
• pp.716-723
• /
• 1995

갈조류인 한국산 곰피(Ecklonia stolonifera)에서 fucoidan을 추출 정제하여 분자 구조적 특성을 조사하고 항혈액 응고 활성을 측정하였다. 건조곰피 20.0kg을 $100^{\circ}C$에서 2시간동안 2회 열수 추출하고 ethanol로 침전시켜 crude fucoidan 151.1g을 얻었다. Crude fucoidan을 염화칼슘과 cetyl pyridium chloride(CPC)로서 정제하여 Fucoidan-1을 얻었고 수율은 35.2%였다. 이 Fucoidan-1을 여러조건하에서 DEAE-Toyopearl 650 M 이온교환 chromatography법을 이용하여 정제한 결과 cellulose acetate 막 전기영동상에서 하나의 band를 나타내는 순도가 높은 곰피 Fucoidan-5을 얻었으며 dextran을 표준품으로 gel filtration chromatography를 행한 결과 분자량은 21,000∼23,000이었다. 곰피 Fucoidan-5의 구성당은 fucose 35.7%와 galactose 4.3%이였고, fucose와 황산기의 mole 비는 약 1 : 1이었다. 적외선 흡수 spectrum 에서 $1240\;cm^{-1}$와 $850\;cm^{-1}$ 부근에서 흡수가 확인되었으며 비선광도가 $-127.2^{\circ}$인 것으로 보아 황산기는 주로 ${\alpha}-L-fucose$의 4번 위치의 탄소에 결합되어 있는 것으로 추정할 수 있었다. 또한 곰피 Fucoidan-5를 methyl화하여 가수분해하고 methyl alditol acetate를 만든 후 gas chromatography를 행한 결과 Fucoidan-5는 주로 황산기를 C4에 가진 fucose가 ${\alpha}l-2$결합 또는 ${\alpha}l-3$결합으로 이루어진 다당류임을 추정할 수 있었다. 곰피 Fucoidan-5의 항 thrombin 활성은 heparin(140 units/mg)의 약 1.4배이었다. 이상의 결과에서 CPC법과 이온교환 chromatography법을 사용하여 갈조류인 곰피로부터 분리 정제한 곰피 Fucoidan-5는 순도가 높은 fucoidan임을 알 수 있었고 수율은 28.1%였다.

• 생명과학회지
• /
• 제19권11호
• /
• pp.1581-1590
• /
• 2009

H. fusiformis는 갈조식물, 모자반과의 해조류로서 우리나라의 서해안, 남해안, 및 제주도를 비롯해 중국, 일본 등 아시아 전역에 서식하는 천연자원식물이다. 최근 톳의 항산화 활성에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있으나 항암에 대한 연구 및 분자생물학적 기전연구가 많이 미흡한 편이다. 따라서 본 연구에서는 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 대상으로 톳 에탄올 추출물(EAHF)에 의한 증식억제에 대하여 조사한 결과, 두 세포주 모두에서 EAHF을 처리하지 않은 군과 비교하여 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되었고 심한 형태적 변화를 관찰할 수 있었다. 이러한 유방암 세포의 증식억제 및 형태변화는 MDAMB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었고, EAHF에 의해 유발된 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 측정하였다. MDA-MB-231세포의 경우는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 $400{\mu}g/ml$의 농도에서는 약 23% 정도가 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1 arrest 효과가 높게 나타났다. 또한 염색질 응축과 연관된 apoptotic body 형성과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. MDAMB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰 할 수 있었지만 MCF-7세포에서는 DNA laddering이 거의 관찰되지 않았다. 또한 apoptosis 유발에 관여하는 여러 유전자들의 발현에 EAHF이 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 death receptor에 속하는 여러 유전자의 발현에는 아무런 변화가 나타나지 않았으나, MDA-MB-231 세포에서 pro-apoptotic Bax의 발현 증가와 caspase-9 및 -3의 활성화, caspase-3의 기질 단백질들의 분해 등이 관찰되었다.

• 생명과학회지
• /
• 제20권3호
• /
• pp.416-423
• /
• 2010

열대 저산소 환경에 적응되어 있는 angelfish (Pterophyllum scalare)를 급격한 온도변화($27{\pm}0.5{\rightarrow}18{\pm}0.5^{\circ}C$) 및 DO 변화($6{\pm}1{\rightarrow}18\;ppm$)에 2시간 동안 적응시킨 후 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH) 동위효소의 특성 및 유전자발현을 연구하였다. LDH 동위효소의 특성은 native-polyacrylamide gel 전기영동, Western blot 분석 및 효소활성 측정으로 확인하였다. 전기영동 결과 liver- 및 eye-specific Ldh-C 유전자는 간, 눈 및 뇌 조직에서 발현되었다. Western blot 분석 결과 LDH $A_4$ 동위효소는 $B_4$ 동위효소보다 음극 쪽에 나타났다. 간 조직에서 온도 저하 시 LDH $A_4$ 동위효소가 증가하고 $B_4$ 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH $A_4$ 및 $C_4$ 동위효소가 증가하고 $B_4$ 동위효소는 감소하였다. 눈 조직에서는 온도 저하 시 LDH $A_4$ 및 $B_4$ 동위효소가 증가하고 $C_4$ 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH $A_4$ 및 $B_4$ 동위효소는 증가하지만 $C_4$ 동위효소 및 하부단위체 C를 포함하는 동위효소는 감소하였다. 심장 조직에서는 DO 증가 시 LDH 활성이 증가하였고, LDH $B_4$ 동위효소가 증가하였다. 뇌 조직에서는 온도 저하 시 LDH $A_4$ 및 $B_4$ 동위효소가 증가하였고, DO 증가 시 LDH $B_4$ 동위효소는 증가하였다. 따라서 liver- 및 eye-specific Ldh-C는 DO 변화에 의해 영향을 받으며 간 및 눈 조직에서 LDH $B_4$ 및 $C_4$ 동위효소는 서로 상대적으로 조절되므로 $C_4$ 동위효소는 lactate oxidase로서 기능을 나타내는 것으로 사료된다.

• 한국수산과학회지
• /
• 제19권6호
• /
• pp.547-557
• /
• 1986

전보(Pyeun and Kim, 1986)에서와 같이 고등어 유문수조직에서 정제한 3종의 알칼리성단백질분해효소에 대하여 활성최적조건, 열안정성. 기질친화도, 화학약제에 대한 영향 및 분자량 등을 규명하였다. 각 정제효소의 반응최적조건을 기질별로 검토한 결과, casein에 대하여 Enz. A는 pH 9.4, Enz. B와 Enz. C는 pH 9.8이었으며, Hb에 대하여 Enz. A는 pH 9.2, Enz. B는 pH 10.2, 그리고 Enz. C는 pH 9.8이었고, 최적반응온도는 공히 $45^{\circ}C$였다. 효소농도 $2{\mu}g/ml,\;2\%$ casein 기질의 반응조건에서 반응시간(x)에 대한 활성도 (y)의 관계를 분석한 결과, Enz. A는 60분. Enz. B는 40분, 그리고 Enz. C는 50분까지 1차 반응의 관계가 성립하였으며, 이때의 반응속도식은 Enz. A는 y=3.6x, Enz. B는 Y=6.0x, 그리고 Enz. C는 y=4.2x였다. 열안정성을 검토하기 위하여 $50^{\circ}C$에서 5분간 가열했을때, Enz, A는 $90\%$, Enz. B는 $33\%$, 그리고 Enz. C는 $37\%$가 각각 불활성화하였다. Lineweaver-Burk의 도식에 의한 효소의 기질친화도를 측정한 결과, casein기질에 대하여 Enz. A는 Km이 $5.0{\times}10^{-3}\%$, Enz. B는 Km이 $1.0{\times}10^{-3}\%$, 그리고 Enz. C는 Km이 $3.6{\times}10^{-3}\%$였다. 금속 ion에 의한 영향을 검토한 결과, $Ag^+,\;Hg^{2+}$는 효소활성을 저하시켰으나, $Mn^{2+},\;Sn^{2+}$ 및 $Pb^{2+}$ 이온은 활성을 증가시켰다. Enz. B와 Enz. C는 soybean trypsin inhibitor에 의해 상당히 저해되었다. 따라서 효소 B와 C는 serine 계 단백질분해효소로 판단되었다. SDS-PAG 전기영동과 Sephadex G-100 겔 여과법에 의하여 각 정제효소의 분자량을 측정한 결과, Enz. A는 $27,500{\pm}2.500$, Enz. B는 $20,500{\pm}1,500$, 그리고 Enz. C는 $15,250{\pm}250$이었다.

• 농업과학연구
• /
• 제26권2호
• /
• pp.39-48
• /
• 1999

본 연구는 축우 품종의 유전적 다형성을 분석하여 분자유전수준에서 축우의 품종간 판별과 유전적 유사성을 구명하고자 Holstein종과 한우, Charolais종 및 한우 교잡종의 혈액에서 DNA를 추출하여, PCR(polymerase chain reaction) 기법에 의한 RAPD(random amplified polymorphic DNAs)분석을 실시하고, 소 품종간의 유사도 지수를 추정한 후 UPGMA(unweighted pair-group method using average)방법으로 유사도를 추정하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 축우 품종들로부터 추출된 genomic DNA를 1.5% agarose gel에서 전기영동한 결과, 12.2kb 이상의 단일밴드로 나타났으며, genomic DNA의 순도는 DNA 흡광도 $A_{260}$과 $A_{280}$의 비율로 측정한 결과 그 비율은 1.75~2.10이었다. 2. RAPD기법에 의한 축우 품종의 유전적 다형성을 분석한 결과, 품종판별을 위한 가장 유용한 random primer는 5'-GAC CGC TTG T-3'인 것으로 판명되었다. 3. Primer 부착 온도에 따른 band 양상에 있어서 $33.0^{\circ}C$인 경우는 약 340bp에서 Holstein종과 Charolais종에서는 band가 출현되었으나, 한우와 한우 교잡종에서는 밴드가 나타나지 않았으며, $37.5^{\circ}C$의 경우에는 340bp에서 Holstein종과 한우에서는 밴드가 나타났으나, Charolais종과 한우 교잡종에서는 band가 출현되지 않아 이들 밴드의 유무가 소 품종판별을 위한 유용한 유전적 표지로서의 이용이 가능할 것으로 사료되었다. 4. 축우 품종의 유사도 지수에 있어서는 primer 부착온도를 $33.0^{\circ}C$와 $37.5^{\circ}C$을 종합하였을때 Holstein종과 한우간에는 0.666~0.777이었으며, Charolais종간에는 0.615~0.666이었고, 한우와 Charolais종간에는 0.400~0.461로 다소 낮은 수치를 보였으나, 한우와 한우 교잡종간에는 0.857~0.888로 대체로 높은 계수를 보였다. 5. 이상의 결과를 종합하여 보면 RAPD기법에 의하여 random primer 5'-GAC CGC TTG T-3'으로 축우 품종의 판별이 가능하며, UPGMA에 의한 축우 품종의 유사도는 Holstein종과 한우 및 Charolais종간 보다는 한우와 한우 교잡종 및 Charolais종간의 유전적 유사도가 높은 것으로 나타났다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제40권2호
• /
• pp.98-103
• /
• 1993

연구배경 : Retinoblastoma 유전자(Rb)의 비활성화는 여러 종류의 암에서 관찰되어 왔다. Rb의 이형성의 소실(loss of heterozygosity)은 Rb의 비활성화의 가장 흔한 기전으로 소세포폐암에서는 거의 모든 예에서 관찰되나 비소세포폐암에서는 훨씬 낮은 빈도로 관찰된다고 알려져 있다. 이에 저자들은 개흉수술시 얻은 한국인의 비소세포폐암 및 정상폐조직의 DNA 에서 Rb의 변화를 관찰하였다. 방법: 폐암조직 및 정상폐조직에서 proteinase K에 의한 소화 및 phenol-chloroform 추출 방법으로 genomic DNA를 추출한 후 제한효소인 EcoRI으로 소화시키고 agarose gel 에서 전기영동분리시켰다. Southern blot 방법으로 DNA를 nylon 막에 흡착시킨 후 Rb 1 탐식자로 hybridization 시켜 stringent condition에서 세척하여 X-ray 필름에 적당기간 노출시켜 현상하였다. 결과 : 26예의 편평상피세포암중 16예에서 정상폐 DNA 에서 RFLP에 의한 Rb의 이형성이 관찰되었으며 이중 10예 (62.5%)의 폐암조직 DNA 에서 이형성의 소실이 관찰되었다. 17예의 폐선암중 11예의 정상폐 DNA 에서 RFLP에 의한 Rb의 이형성이 관찰되었으며 이중 5예 (45.4%)의 폐암 DNA 에서 이형성의 소실이 관찰되었다. Rb의 비활성화 유무에 따른 두 군 사이에 연령, 성별, 암의 병기, 암의 분화도 및 흡연력의 차이가 없었다. 결론: 이상의 결과로 Rb의 비활성화는 비소세포폐암의 발생기전에 중요한 역할을 하리라 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제44권6호
• /
• pp.1245-1255
• /
• 1997

연구배경 : 결핵균의 rpoB 유전자는 Rifampicim이 결합하여 약리작용을 나타내는 RNA polymerase의 $\beta$-subunit을 encoding하는 유전자이다. 최근 PCR-SSCP 등의 다양한 방법을 이용하여 rpoB 유전자의 돌연변이를 발견함으로써 결핵균 다제약제내성의 지표인 Rifampicin 내성을 조기에 진단할 수 있는 방법에 대한 여러 보고가 있다. 그러나 대부분 배양된 검체를 대상으로 하였고 객담등의 임상검체를 직접 대상으로 한 연구는 별로 없었다. 본 연구는 직접 임상검체를 대상으로 결균의 rpoB유전자 PCR-SSCP를 시행함으로써 rifampicin 내성을 신속히 진단할 수 있는지 알아보았다. 대상 및 방법 : 1996년 6월부터 8월까지 아산재단 서울중앙병원에서 항산성도말검사 양성인 75검체를 대상으로 하였다. 이종 결핵균의 IS6110분절을 이용한 중합효소 연쇄반웅이 양성이고 RFP 감수성검사 결과가 확인된 43검체를 대상으로 하였다. Bead beater법으로 DNA를 추출하여 heminested PCR을 시행하였고 MDE gel을 이용하여 SSCP를 시행하였다. 이 검체즐은 배양 즉시 대한결핵협회에 감수성검사를 의뢰하여 PCR-SSCP 결과와 rifampicin 감수성검사 결과를 비교하였다. 결 과 : 75검체중 55예(73%)에서 IS6110분절에 대한 PCR 양성이었다. 이중에서 RFP에 대한 강수성결과가 확인된 43예를 대상으로 하였다. 29예는 표준균주인 H37Rv와 동일한 전기영동상의 이동성을 보였고, 14예는 다른 이동성을 보여 주었다. 동일한 이동성을 보인 29예 모두 감수성검사상 RFP감수성으로 판명되었고, 다른 이동성을 보인 14예 모두 RFP 내성으로 판명되었다. 즉 기존의 전통적인 RFP 감수성검사 결과와 직접임상검체에서 rpoB 유전자를 이용한 PCR-SSCP분석은 100% 일치하였다. 결 론 : 임상검체에서 직접 rpoB 유전자의 heminested PCR을 이용한 SSCP 법은 Rifampicin내성을 신속히 진단할 수 있는 방법으로 기대된다.