오대산에 자생하는 야생버섯 60종의 메탄올추출물을 이용하여 혈관계 질환과 당뇨병의 치료에 효과 있는 버섯을 확인하기위해, 혈전용해 활성과 ${\alpha}-glucosidase$ 저해 활성을 확인한 결과 11종의 버섯이 혈전용해 활성을 나타냈고, 6종의 버섯이 50% 이상의 ${\alpha}-glucosidase$ 저해 활성을 나타냈다. 뽕나무버섯류가 4.2 plasmin units의 가장 큰 혈전용해 활성을 나타냈으며, 독우산광대버섯, 미치광이 버섯류, 민자주방망이버섯이 2.3 plasmin units, 애괄대버섯은 2.1 plasmin units, 흰보라끈적버섯은 2.0 plasmin units 의 높은 혈전용해 활성을 나타냈다. ${\alpha}-Glucosidase$ 저해 활성 측정결과 노란다발버섯이 98.5%의 가장 큰 저해 활성을 나타냈고 비단그물버섯과 점마개버섯도 60% 이상의 높은 저해 활성을 나타냈다. 본 연구는 뽕나무벗섯류와 노란다발버섯은 혈관계질환 치료용 의약이나 기능성 식품으로 개발될 수 있음을 보여준다.
잎새버섯으로 준비된 물 추출물과 유기용매 분획물의 혈전용해활성과 트롬빈저해활성, acetylcholinesterase 저해활성, 항산화활성 및 면역활성을 확인하였다. 물 추출물과 물 분획물은 각각 1.55 plasmin unit와 0.85 plasmin unit의 높은 혈전용해활성을 나타내고, 물 분획물과 에틸 아세테이트 분획물은 76.43%와 72.59%의 트롬빈저해활성을 나타냈다. 클로로포름 분획물과 헥산 분획물이 95.14%와 94.74%의 높은 acetylcholinesterase 저해활성을 나타냈으며, 부탄올 분획물과 물 추출물이 94.47%와 91.04%의 항산화활성을 나타냈다. 부탄올 분획물과 물 분획물이 각각 2배 이상의 높은 면역기능활성을 나타냈다. 실험 결과로부터 잎새버섯의 분획물은 높은 혈전용해활성, 트롬빈 저해활성, acetylcholinesterase 저해활성 및 면역 기능활성을 나타내 심혈관계 질환과 치매의 예방 및 면역 기능강화를 위한 기능성식품 개발에 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
백일주는 찹쌀, 백미, 누룩, 재래종 국화꽃, 오미자, 진달래, 솔잎 및 물을 넣고 100일간 발효 숙성시킨 전통주이다. 본 연구에서 백일주의 생리활성을 알아보기 위하여 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량, 항산화 활성(DPPH 라디칼, ABTS 라디칼, 아질산염 소거활성), 혈전용해활성, angiotensisn 전환효소 저해활성 및 acetylcholinesterase 저해활성을 평가하였다. 살균 처리되지 않은 백일주와 살균 처리된 백일주의 총 폴리페놀 함량은 391.59와 401.33 ${\mu}g$ tannic acid equivalents/ml이었고, 총 플라보노이드 함량은 284.75와 308.35 ${\mu}g$ quercetin equivalents/ml이었다. 백일주의 항산화 활성(DPPH 라디칼, ABTS 라디칼, 아질산염 소거활성)은 청주 보다 우수한 것으로 나타났다. 또한 백일주의 혈전용해활성과 acetylcholinesterase 저해활성도 청주에 비해 우수한 것으로 나타났다. 반면에 angiotensin 전환효소 저해활성을 측정한 결과 살균 처리되지 않은 백일주는 23.62%, 살균 처리된 백일주는 19.99%, 청주는 38.91%로 청주가 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과는 백일주가 항산화 효과와 혈전용해 활성이 있음을 시사하고 있다.
의료용 단백질로 중요한 인체 혈관 내피세포 유래 t-PA를 알팔파 식물체를 이용하여 생산하는 기술을 개발하였다. 식물체에서 발현된 t-PA는 동물세포에서 생산된 t-PA와 동등한 시험관 내의 인공 혈전 용해 활성 및 생화학적 특성에서 유사함을 가지고 있었다. 본 연구에서는 식물체에서 발현되는 t-PA 단백질의 알팔파 코돈 이용에 최적화된 합성 유전자이용 양적 증대, 소포체에 표적에 따른 발현양 증대, 6개의 histidine의 부착에 따른 정제의 효율성을 고려하였고 두 종류의 프로모터 (CaMV 35S와 알팔파 Rbcsk-1A)를 이용하여 t-PA 및 파생 단백질들의 발현 효율을 비교 확인하고자 6가지의 식물발현 벡터를 제작하였다. 0.3%의 제초제 살포 후에 저항성을 갖는 알팔파 식물체들의 t-PA 유전자 및 파생 유전자의 genomic DNA내의 삽입 유무는 PCR법을 활용하여 t-PA, 파생 유전자 및 합성 유전자의 크기에 해당하는 1.6 kb의 PCR 산물을 확인 할 수 있었다. 6가지 발현벡터로 형질전환된 알팔파 잎 추출물에서 전체 수용성 단백질내의 t-PA 및 파생 단백질의 평균 발현양은 $9.7-39.5{\mu}g/TSP$ (mg)로 측정되었다. 이중 p221a-t-PAER 발현벡터로 형질전환된 알팔파의 잎 추출물에서 가장 높은 $75.1{\mu}g/TSP$(mg)의 발현양을 나타났다. 알팔파 잎에 발현된 재조합 t-PA 분자량은 상업적으로 판매되는 t-PA와 동일한 68 kDa으로 확인되었다. 형질전환된 알팔파 잎 추출물들의 평균 피브린 용해활성은 3.2-8.1cm를 나타내었다. 또한 t-PA 및 그의 파생 단백질을 발현하는 알팔파 식물체는 야생종 알팔파와 비교했을 때 성장에 있어서 별 다른 차이를 보이지 않았다.
본 연구는 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어지는 버섯의 기능성 소재로서의 타당성을 검증하기 위하여 버섯 추출물의 유효성분 함량(polyphenol, $\beta$-glucan)과 저분자 및 고분자 분획물의 항산화 활성, 혈전용해 활성, 면역증강 및 항염증 활성 등을 측정하였다. 그 결과 전체 수율은 식용버섯이 약용버섯보다 높게 나타났으며, $\beta$-glucan의 함량은 표고버섯(33.5%)이 가장 높게 나타났다. Polyphenol 함량은 약용버섯인 상황버섯(LMW)이 233.23 mg/g로 가장 높게 나타났으며, 애느타리버섯(LMW) 12.18 mg/g, 송이버섯(LMW) 11.72 mg/g 순으로 확인되었다. 버섯 추출물의 항산화 능력을 측정하기 위한 전자공여능 측정 결과는 ascorbic acid 0.5 mg/mL에서 95.91%의 저해율을 나타낸 것에 비하여 상황버섯(LMW, 10 mg/mL)이 80.74%의 억제활성을 나타내었다. SOD 유사활성 측정에서는 대부분의 버섯 추출물에서 큰 차이를 나타내지 않았으며, 아질산염 소거능 측정에서는 pH의 감소에 따라 소거능이 증가하였고, 상황버섯(LMW)이 가장 높은 소거능을 나타내었다. 이처럼 버섯 추출물의 항산화능력 측정에서 phenol성 물질을 많이 함유하고 약용버섯으로 사용되는 상황버섯이 식용버섯(송이버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 느타리버섯, 애느타리버섯, 표고버섯, 팽이버섯) 보다 LMW 분획에서 우수한 항산화 능력을 갖는 것을 알 수 있었다. 그러나 혈전용해 활성을 측정한 결과에서 대부분의 LMW 분획물들은 혈전용해 활성을 갖지 않았으며, 송이 버섯(HMW, 50 mg/mL)이 60.4%의 가장 높은 혈전용해 활성을 나타내었다. 또한 RAW 264.7 cell을 이용한 대식세포 활성능(NO 생성)을 측정한 결과 LMW 분획에서는 대식세포 활성능력이 거의 없는 것으로 조사되었으며, 대조군인 LPS 500 ng/mL를 첨가한 상태에서 $32.9\;{\mu}M$의 NO를 생성하는 것과 비교하여, 표고버섯(HMW, $500\;{\mu}g/mL$) $39.86\;{\mu}M$, 송이버섯 $35.17\;{\mu}M$의 NO 생성능을 나타내었다. 또한 약용버섯인 상황버섯(HMW)은 NO 생성능력이 거의 나타나지 않았다. 반면에 RAW 264.7 cell로부터 LPS에 의해 유도된 NO 생성 저해활성을 측정한 결과 상황버섯(LMW) $500\;{\mu}g/mL$의 농도에서 NO의 생성을 100% 저해하였고, 새송이버섯(LMW)은 $50\;{\mu}g/mL$에서 58.14%, $500\;{\mu}g/mL$에서 67.79%의 저해활성을 나타내었다. 이상의 결과로부터 phenol 성분을 다량 함유하고 있는 상황버섯(LMW)은 일반적인 식용버섯에 비해 항산화능이 우수함을 알 수 있었으며, 혈전용해능력(송이버섯, I)과 면역증강(표고버섯, VII) 그리고 항염증(새송이버섯, II)에서는 식용버섯의 HMW 분획물이 우수한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
Bacillus amyloliquefaciens CH51은 분자량 27 kDa 크기의 subtilisin 타입의 혈전용해능을 지니는 단백질분해효소인 AprE51을 생산하였다. 이전연구에서 더 우수한 혈전용해 활성을 갖는 AprE51-6이 세포외 돌연변이법으로 생산되었으며, 본 연구에서는 이 개선된 효소인 AprE51-6의 열안정성을 증진시킬 목적으로 B. subtilis subtilisin E의 아미노산과의 상동성 분석을 통하여 두 아미노산인 Gly-166과 Asn-218이 치환되었다. 그 결과 G166R과 N218S 돌연변이체는 혈전용해능을 보이는 용해능 배지에서 원 효소보다 각각 1.8배와 4.5배 높은 혈전용해능을 보였다. 정제된 두 돌연변이효소인 AprE51-7과 AprE51-8는 원효소인 AprE51-6에 비하여 1.9 그리고 2.5배 높은 $k_{cat}$값을 나타내었고, 2.1과 1.9배 낮은 기질친화력을 나타내는 $K_m$값을 보여주었다. 특히 AprE51-8는 나토키나아제에 비하여 알칼리 pH 영역에서 높은활성을 유지하였고, $60^{\circ}C$에서 더 우수한 열안정성을 보여주었다. 열안정성의 정도를 나타내는 척도인 반감기 값에서도 AprE51-7과 AprE51-8는 $50^{\circ}C$에서 21.5분과 27.3분으로 기존의 AprE51보다 2배 그리고 2.6배 더 긴 반감기를 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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