Objective: Nanog homeobox (NANOG) is a core transcription factor that contributes to pluripotency along with octamer binding transcription factor-4 (OCT4) and sex determining region-Y box-2 (SOX2). It is an epiblast lineage marker in mammalian pre-implantation embryos and exhibits a species-specific expression pattern. Therefore, it is important to understand the lineage of NANOG, the trophectoderm, and the primitive endoderm in the pig embryo. Methods: A loss- and gain-of-function analysis was done to determine the role of NANOG in lineage specification in parthenogenetic porcine blastocysts. We analyzed the relationship between NANOG and pluripotent core transcription factors and other lineage makers. Results: In NANOG-null late blastocysts, OCT4-, SOX2-, and SOX17-positive cells were decreased, whereas GATA binding protein 6 (GATA6)-positive cells were increased. Quantitative real-time polymerase chain reaction revealed that the expression of SOX2 was decreased in NANOG-null blastocysts, whereas that of primitive endoderm makers, except SOX17, was increased. In NANOG-overexpressing blastocysts, caudal type homeobox 2 (CDX2-), SOX17-, and GATA6-positive cells were decreased. The results indicated that the expression of primitive endoderm markers and trophectoderm-related genes was decreased. Conclusion: Taken together, the results demonstrate that NANOG is involved in the epiblast and primitive endoderm differentiation and is essential for maintaining pluripotency within the epiblast.
포유류 배반포배의 epiblast는 내세포괴에 포함되어 있으며, 이 epiblast cells이 배 및 태아의 생식세포와 일반 체세포로 분화된다 (Beddington, 1986; Lawson 등, 1991). 그런데 조기에 발달된 부화배반포기 배가 지연발생된 부화배반포기 배보다도 많은 epiblast cells을 가지고 있다고 한다(Talbot 등, 1995). 그래서 본 연구에서는 체외수정 유래의 배반포배의 발육속도에 따른 내세포괴/영양배엽세포의 비율 및 배아간세포 확립 효율을 비교하여 발달일령 간에 차이가 있는지를 규명하고자 하였다. 공시한 소의 난포란을 TCM-199에 0.5$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 5$\mu\textrm{g}$/ml LH, 10% FBS, 100 units/ml penicilin, 및 100$\mu\textrm{g}$/ml streptomycin을 첨가하여 39$^{\circ}C$, 5% CO2 조건하에서 24시간 동안 체외성숙한 후, 5$\mu\textrm{g}$/ml heparin으로 수정능이 획득된 1$\times$106 sperm/ml의 정자로 체외수정을 유도하였다. 체외수정 후 18~20시간에 과립막세포를 vortexing으로 제거하여 얻은 모든 체외수정란을 3mg/ml BSA, 20${\mu}\ell$/ml NEM amino acids, 40${\mu}\ell$/ml BME amino acids, 10mM glycine 및 1mM alanine이 함유된 CR1aa 배양액에서 BRL 단층세포와 공배양을 실시하였다. 수정후 7, 8 및 9일재 (체외수정일 : 0일)에 확장배반포기까지 발달한 수정란을 이중염색 및 배아간세포의 확립 실험에 공시하였다. 체외수정후 24시간에 분할된 총 1,145개의 수정란이 7, 8 및 9일째에 후기 배반포기까지 각각 222(15.6%), 103(7.2%) 및 52(3.6%)로 발달하여 총 377개 (26.4%)가 발달하였다. 내세포괴/영양배엽세포의 비율은 7일 및 8일째 배반포배에서 각각 47.2$\pm$11.9/95.1$\pm$24.4개 (33/67%) 및 40.3$\pm$12.4/83.3$\pm$26.9개 (33/67%)로서 9일째 배반포배의 19.3$\pm$8.1/62.3$\pm$23.1개 (24/76%) 보다 유의적(P<0.05)으로 높았다. ES-like cells을 확립하기 위하여 후기배반포기 배를 mouse embryonic fibroblast 단층 공배양기에 옮긴 후 5일에 내세포괴의 부착 여부를 판정하고, 10일에 배아간세포의 확립 여부를 판정하였다. 그 결과 7, 8 및 9일째의 배반포기배의 각각 47.7% (82/172), 30.9%(22/71) 및 15.6%(5/32)에서 배아간세포가 확립되었다. 이상의 결과에서 배반포기까지의 발육이 빠른 수정란에서 영양배엽에 대한 내세포괴세포의 비율이 높았고 배아간세포의 확립율도 높다는 사실을 입증할 수 있었으며, 이와 같은 결과에서 체외수정란 유래 배반포배의 질을 결정할 수 있을 것으로 생각된다.
This study was carried out to evaluate the potential for preselection of transgenic embryos prior to transfer into recipient animals. In these experiments, I used a 3.2 kb transgene which contained the neomycin resistance gene (neo) and lac Z gene driven by the $\beta$ actin promoter (iacZ Ineo). Oocytes were aspirated from abattoir ovaries, matured in TCM-199 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ${\mu}\textrm{g}$/ml LH, 0.5 ${\mu}\textrm{g}$/ml FSH, 100 unit/ml penicillin, and 100 ${\mu}\textrm{g}$/ml streptomycin for 22 to 24 hrs then inseminated with a sperm suspension of 1 X 10$^6$ sperm/ml containing 5 ${\mu}\textrm{g}$/ml of heparin. At 18-20 hrs after insemination, cumulus cells were removed by vortexing and pronuclei of centrifuged zygotes microinjected with the lacZ/neo construct (3 ng/$\mu$l). All cultures were carried out in CR1aa with transfected BRL monolayers containing 3 mg/ml BSA, 20 $\mu$/ml NEM amino acids and 40 $\mu$I/ml BME amino acids. To identify the appropriate concentration of G418 for selection, non-microinjected zygotes were cultured in the presence of 0, 50, 100 and 200 $\mu$g/ml of G418. After 8 days of culture in these treatments, 44/145 (30.3%), 13/150 (8. 7%), 1/151 (0.7%) and 0/134 (0.0%) devel-oped to the blastocyst stage in 0, 50, 100 and 200 $\mu$g/ml of G418, respectively. A total of 1,127 zygotes were microinjected and placed into culture (without G418) and subsequently 710 (63.0%) cleaved. At 48 hrs post-injection, embryos ($\geq$2-cell) were randomly assigned to control (medium alone) or G418 (100 ${\mu}\textrm{g}$/ml) treatments. A control culture of 740 non-microinjected embryos from the same replicates of embryos were also placed into control medium. After 8 days in culture, 54/343 (15.7%) and 22/367 (6.0 %) of the microinjected embryos developed to the blastocyst stage in control and G418 media, respectively. A total of 151/740 (27.2%) of the non-microinjected embryos placed in the control medium developed to the blastocyst stage. The blastocysts in the control treatment had a mean of 70.7 ${\pm}$ 4.7 cells of which 23.1 ${\pm}$ 2.6 (32.7%) stained for $\beta$-Gal activity. B1astocysts in the G418 treatment had a mean of 48.8${\pm}$7.5 cells of which 40.3 ${\pm}$ 4.1 (82.6%) stained for $\beta$-Gal ac tivity (P<0.05). In the control treatment 26 of 30 (87.0%) blastocysts had some cells with $\beta$-Gal activity while all of the blastocysts in the G418 treatment had some cell with $\beta$-Gal ac tivity (P<0.05). However, ICM colonies in either control or G418 treatments were not expressed any epiblast cell except of trophetoderm celIs. The $\beta$-actin promoter/lacZ gene may not be e expression or silence expression in epiblast cells These results clearly show an enrichment of blastocysts expressing the transgene in the majority of their cells after culture in the presence of G418. The exogeneous gene was not express a and silence in ICM colonies especiallly epiblast cells except of trophectederm cells. Even though the higher rate cell number expressed of exogeneous gene in the G418 treatments, a total cell number was decrease significantly (P<0.05) of which might be also drop of the establishment of ES like-cell colonies and production of transgenic animals. However, futher studies need to determine the viability of these selected embryos and the avability of production of transgenic offspring.
Primordial germ cells (PGCs) in aves are the progenitor cells for the gametes. These cells first appear in the epiblast (Eyal-Giladi et al.. 1981). Then translocate and concentrate to endoderm of germinal crescent area in the junction of the area opaca and area pellucida lateral to the primitive streak in stage 4 through 7. They separate from the endoderm, temporarily circulate via the blood vascular system, leave the blood vessels, and finally settle down in the gonadal anlagen at stage 20-24 where they rapidly proliferate to form germ cells. Recently, several attempts have been made to introduce foreign gene into the avian genome to form a transgenic chicken. The stem cells most readily available as vehicles for genetic manipulation of germline in avian species are the PGCs. PGCs have recently been manipulated genetically and used successfully as a vector for gene transfer.
Pluripotent stem cells could self-renew and differentiate into various cells. In particular, porcine pluripotent stem cells are useful for preclinical therapy, transgenic animals, and agricultural usage. These stem cells have naïve and primed pluripotent states. Naïve pluripotent stem cells represented by mouse embryonic stem cells form chimeras after blastocyst injection. Primed pluripotent stem cells represented by mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells. They could not produce chimeras after blastocyst injection. Populations of embryonic stem cells are not homogenous; therefore, reporter systems are used to clarify the status of stem cells and to isolate the cells. For this reason, studies of the OCT4 reporter system have been conducted for decades. This review will discuss the naïve and primed pluripotent states and recent progress in the development of porcine OCT4 reporter systems.
Secondary neurulation (SN) is a critical process to form the neural tube in the posterior region of the body including the tail. SN is distinct from the anteriorly occurring primary neurulation (PN); whereas the PN proceeds by folding an epithelial neural plate, SN precursors arise from a specified epiblast by epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), and undergo self-renewal in the tail bud. They finally differentiate into the neural tube through mesenchymal-to-epithelial transition (MET). We here overview recent progresses in the studies of SN with a particular focus on the regulation of cell lineage, self-renewal, and EMT/MET. Cellular mechanisms underlying SN help to understand the functional diversity of the tail in vertebrates.
The putative totipotency germ cells has a relative abundance of alkaline phosphatases. Thus, histological staining of AP activity offers a new route to isolate totipotent cells and also provides insights into culture systems of these cells. Furthermore, the AP staining technique is simple and fast, requires only the napthol AS/MS substrate in combination with trapping diazonium salts such as fast red or fast blue. However, our unexpected finding was that AP staining of mouse ES cells were detected in the undifferentiaed epiblast-derived cells as well as several types of differentiating cells. This findings are different from results of Talbot et al. (1993) reported usefulness of the AP staining and implies that histological staining of AP may not by useful to determine undifferentiaed state or totipotency of ES cells. Thus, we have investigated the patterns of AP expression by RT-PCR in order to identify a marker of undifferentiated ES/primordial germ (PG) cells. In RT-PCR analysis, embryonic (E)-AP was detected only in undifferentiated ES cells, but intestinal(I)-AP was not detected in all of the examined ES and PG cells. In addition, nonspecific (NS)-AP wasdetected in undifferentiated PG cell from day 7, 5 to 13 of gestation. Histological activity of AP in ES cells was completely suppressed by addition of L-phenylalanine (Phe), L-homoarginine (Har), and L-phenylalanylglycylglycine (PheGlyGly) as an inhibitor, but RT-PCR showed the same results as in the absence of an inhibitors. Our findings suggested that expression of E-AP and NS-AP may use as a marker to determine the undifferentiated status in ES and PG cells.
D. K. Kim;G. H. Song;J. N. Kim;D. K. Jeong;K. D. Kim
Korean Journal of Poultry Science
/
v.28
no.1
/
pp.69-76
/
2001
Avian primordial germ cells (PGCs) originate from the epiblast and appear in the germinal crescent. These PGCs enter the developing blood vessels during stage 10∼12 (H&H), circulate in the blood stream, migrate into the developing gonadal anlage and differentiate into germ cells. However, it is not clear until when the migratory ability of PGC is maintained. This study was conducted to examine whether migratory ability is present in PGCs from the gonad at later embryonic developmental stages. In the present study, gonads were dissected from 5-, 6- and 10-day old quail embryos and treated with trypsin-EDTA. Gonadal PGCs (gPGCs) were purified by Ficoll-density-gradient-centrifugation and labeled with PKH26 fluorescent dye. The PKH26-labeled gPGCs were microinjected into the blood vessel of the recipient quail embryo. Manipulated recipients were incubated for 3 days, embedded in paraffin and sdctioned. The foreign gPGCs were detected by fluorescent and confocal laser microscopy. As a result, quail gPGCs, from 10, 6 and 5 day old embryos could migrate through the recipient blood stream at early stage and settle in the gonads. Thus, results suggest that gPGCs from upto 10-day old embryos keep properties seen in circulating PGC. Therefore, the PGCs of 10-day old embryonic gonads can be used for the tools of genetic manipulation.
In-Won Lee;Hyeon-Geun Lee;Dae-Ky Moon;Yeon-Ji Lee;Bo-Gyeong Seo;Sang-Ki Baek;Tae-Suk Kim;Cheol Hwangbo;Joon-Hee Lee
Journal of Animal Reproduction and Biotechnology
/
v.38
no.3
/
pp.109-120
/
2023
Background: Pluripotent stem cells (PSCs) including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer the immense therapeutic potential in stem cell-based therapy of degenerative disorders. However, clinical trials of human ESCs cause heavy ethical concerns. With the derivation of iPSCs established by reprogramming from adult somatic cells through the transgenic expression of transcription factors, this problems would be able to overcome. In the present study, we tried to differentiate porcine iPSCs (piPSCs) into endothelial cells (ECs) for stem cell-based therapy of vascular diseases. Methods: piPSCs (OSKMNL) were induced to differentiation into ECs in four differentiation media (APEL-2, APEL-2 + 50 ng/mL of VEGF, EBM-2, EBM-2 + 50 ng/mL of VEGF) on cultured plates coated with matrigel® (1:40 dilution with DMEM/F-12 medium) for 8 days. Differentiation efficiency of these cells were exanimated using qRT-PCR, Immunocytochemistry, Western blotting and FACS. Results: As results, expressions of pluripotency-associated markers (OCT-3/4, SOX2 and NANOG) were higher observed in all porcine differentiated cells derived from piPSCs (OSKMNL) cultured in four differentiation media than piPSCs as the control, whereas endothelial-associated marker (CD-31) in the differentiated cells was not expressed. Conclusions: It can be seen that piPSCs (OSKMNL) were not suitable to differentiate into ECs in the four differentiation media unlike porcine epiblast stem cells (pEpiSCs). Therefore, it would be required to establish a suitable PSCs for differentiating into ECs for the treatment of cardiovascular diseases.
Proceedings of the Korean Society of Embryo Transfer Conference
/
2002.11a
/
pp.118-118
/
2002
Programmed cell death (PCD) is thought as a well-controlled process by which unwanted cells are selectively eliminated. During the last decade many researches have elucidated molecules and their interactions involved in cell death by using largely in vitro induction of cell death or survival signals in a more defined manner, While these critical information and novel findings provide us with clearer understanding of mechanisms underlying cell death, it does by no means explain how PCD occurs and which cells or tissues are affected during normal embryonic development in vivo. In this study, we used zebrafish to examine whether the PCD is occurring selectively or randomly in developing embryos by whole mount in situ TUNEL analysis with specific markers for neural cells. The result revealed that the degree and distribution of TUNEL staining varied considerably throughout gastrulation stage, and there was also a number of TUNEL-negative embryos. Most of TUNEL-positive cells were scattered randomly throughout the blastoderm. During the gastrulation stage about 75 % of the embryos analyzed exhibited more than 5 TUNEL-positive cells. As the dorsal epiblast begins to thicken rather abruptly near the end of gastrulation, TUNEL-positive cells were mainly located along the dorsal side. Although there were some variations in TUNEL staining during segmentation and pharyngeal stages, TUNEL staining continued to be localized to the central nervous system, and was also detected in the sensory organs, trigeminal ganglions, and the primary sensory neurons. High levels of the cell death in developing brain between 20-somite and prim-6 stages are thought to play a role in the morphogenesis and organization of the brain. At prim-16 stage, cell death is considerably reduced in the brain region. Dying cells are mainly localized to the prospective brain region where ectodermal cells are about to initiate neurogenesis. As development progressed, high levels and more reproducible patterns of cell death were observed in the developing nervous system. Intensive TUNEL staining was restricted to the trigeminal ganglions, the primary sensory neurons, and sensory organs, such as olfactory pits and otic vesicles. Thus, PCD patterning in zebrafish embryos occurs randomly at early stages and becomes restricted to certain region of the embryos. The spatio-temporal pattern of PCD during the early embryonic development in zebrafish will provide basic information for further studies to elucidate genes involved in. regulation of PCD largely unknown in vivo during vertebrate embryogenesis.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.