• Applied Biological Chemistry
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• 제46권3호
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• pp.171-175
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• 2003

실험실 배양 조건에서는 발현되지 않는 대장균 K-12의 endochitinase 유전자(yheR)를 PCR로 증폭하여 pET28c와 pQE9벡터에 각각 클로닝 하였다. yheB유전자를 가진 pET28c와 pQE9 벡터를 함유한 대장균에서 생산된 endochitinase는 생장배지 내로 일부 분리되었다. 과량 생산된 endochitinase를 His-affinity 크로마토그래피와 DE-52 크로마토그래피로 부분 정제하였으며 SDS-PAGE에 의한 단백질의 분자량은 약 97,000 이었다. 정제된 효소의 최적 pH는 6이었으며 최적 온도는 $40^{\circ}C$이었다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제43권4호
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• pp.246-249
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• 2000

We investigated the production of chitin oligosaccharides using food grade papain. A solution of commercial food grade papain (FGP) was dialyzed for 12 h before measuring its chitinolytic activity. The effects of enzyme concentration, reaction temperature, and pH on the endochitinase and $\beta$-N-acetylglucosaminidase activities and the thermostability of these enzymes were investigated. In adddition, the reaction products were analyzed with gel filtration on a Bio-Gel P2. The endochitinase activity was twentyfold higher than that of $\beta$-N-acetylglucosaminidase. The optimal endochitinase activity was at pH 3.0, while the maximal $\beta$-N-acetylglucosaminidase activity was at pH 6.0. The reaction product consisted mainly of the dimer of N -acetylglucosamine, with a small amount of its trimer. Under the experimental conditions, $120{\mu}g$ of chitin oligomers were obtained with 1 mg of FGP protein after an incubation of 2 h.

• 산업기술연구
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• 제30권B호
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• pp.69-74
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• 2010

Chitinolytic activity was enhanced by coexpression of endo-chitinase gene (chiA) and chitobiosidase gene (chiB) from Serratia marcescens KFRI314 using constitutive expression vector, pHCEIA, in E. coli. Coexpression vector was constructed by inserting ribosome binding site (RBS) into junction between two chitinase genes. SDS-PAGE analyses showed that two chitinase were constitutively expressed while E. coli clones expressing two chitinases simultaneously increased halo size on colloidal chitin plate. Furthermore, the chitinolytic activities were much enhanced in coexpressed clones when degradation patterns of substrate analogues such as 4-MU-(NAG), $4-MU-(NAG)_2$,$4-MU-(NAG)_3$ were used. Consequently, the combined use of endochitinase and chitobiosidase greatly increased overall chitinolytic activities on recombinant E. coli clones.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.466-471
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• 1996

키틴을 효소적인 방법으로 분해하여 키틴 올리고머를 생산할 수 있는 값싸고 안정적인 효소원을 확보하기 위하여 벼, 콩, 참다래, 아몬드, 조(粗)파파인 등의 식물체로부터 키틴분해효소를 탐색하였다. 왕겨, 콩껍질, 참다래의 외피 등에서 키틴분해효소의 활성이 나타났으며 껍질을 제거한 콩, 쌀기울, 백미, 탈지 대두분 등에서는 활성이 없었다. 이들 키틴분해효소는 exochitinase와 endochitinase 형태의 두종류 활성을 갖는 것이 관찰되었으며, 참다래와 조(粗)파파인에서 endochitinase의 활성이 높았다. pH의 영향은 exochitinase의 경우 효소원에 따라 $pH\;5{\sim}7$ 사이에서 최대활성을 나타내었고 endochitinase는 모두 pH 3과 $pH\;5{\sim}6$의 두 곳에서 최대활성을 나타내었다. 온도변화에 의한 exochitinase의 활성은 $50^{\circ}C$에서도 비교적 안정했다. 반면에 endochitinase는 종류에 따라 다양한 최적 온도를 갖는 것이 관찰되었다. 또한 이들 조효소는 키토산분해 활성을 갖고 있었으며 왕겨가 가장 높고 콩껍질, 참다래의 순서였다. 키틴을 이용한 키틴올리고머의 생산을 위한 가장 적합한 효소원으로는 exochitinase의 활성이 가장 적으며 endochitinase의 활성이 높은 조(粗)파파인이 가장 적합한 것으로 사료되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제7권2호
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• pp.107-113
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• 1997

A strain producing a high amount of chitinase was isolated from soil, identified as Pseudomonas sp., and tentatively named Pseudomonas sp. YHS-A2. An extracellular chitinase of Pseudomonas sp. YHS-A2 was purified according to the procedure of ammonium sulfate saturation, affinity adsorption, Sephadex G-100 gel filtration and Phenyl-sepharose CL-4B hydrophobic interaction column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 55 kDa on SDS-PAGE was confirmed by active staining. Optimal pH and temperature of the enzyme are pH 7.0 and $50^{\circ}C$, respectively, and the enzyme is stable between pH 5.0 and 8.0 and below $50^{\circ}C$. The main products of colloidal chitin by the chitinase were N-acetyl-D-glucosamine and N,N'-diacetylchitobiose both of which were detected by HPLC analysis. The enzyme is supposed to be a random-type endochitinase which can degrade any position of ${\beta}$-l,4-linkages of chitin and chitooligosaccharides. The chitinase inhibited the growth of some phytopathogenic fungi, Fusarium oxysporum, Botrytis cineria, and Mucor rouxii and these antifungal effects were thought to be due to the characteristics of endochitinase.

• Applied Biological Chemistry
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• 제40권2호
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• pp.95-100
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• 1997

키틴을 효소적인 방법으로 분해하여 키틴올리고머를 생산할 수 있는 값싸고 안정적인 효소원을 확보하기 위하여 농어, 방어, 대구, 닭 등의 동물체로 부터 키틴분해효소를 탐색하였다. 각 효소원의 장기와 소화액 및 달팽이 ${\beta}-glucuronidase$로 부터 키틴분해활성을 측정한 결과, 대구와 닭은 키틴을 주로 중합도 $3{\sim}5$의 크기로 분해하며 endochitinase의 활성도가 exochitinase활성보다 $7{\sim}10$배 높았다. 달팽이 ${\beta}-glucuronidase$는 키틴을 모두 N-acetylglucosamine으로 분해하였고 닭의 경우 소화기조직과 내용물에서 모두 endochitinase활성이 높았다. 어류중에서 농어는 키틴분해활성을 보이지 않았으며 방어와 대구는 비슷한 수준의 키틴분해활성을 보였다. 이들 효소의 최적pH는 $4{\sim}5$, 최적온도는 $50{\sim}60^{\circ}C$였다. 한편 키토산분해능력은 닭의 소화기내용물과 조직, 대구의 위조직에서 관찰되었으며, 닭 소화기내용물이 가장 높았으나 키틴분해능의 15%에 지나지 않았으며 그 다음은 달팽이의 ${\beta}-glucuronidase$로 닭 소화기내용물의 키토산분해능력의 약 30% 활성을 보였다. 키틴올리고머의 생산을 위한 가장 적합한 효소원으로 exochitinase활성이 적고, endochitinase활성이 높으며 값이 저렴하고 안정적인 공급이 가능한 닭의 소화기가 적합한 것으로 사료되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제37권4호
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• pp.255-258
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• 1994

식물-미생물 상호작용에 관한 연구의 일부로 식물 병저항성 단백질로 간주되는 키틴분해효소(Chitinase, EC 3.2.1.14)의 식물 세포간액에의 분포와 유도를 몇가지 조건에서 연구하였다. 강낭콩과 대두의 잎에서 병원균, 상처, 에틸렌 등의 스트레스 조건에서 유도되는 endochitinase 가운데 강낭콩에서는 34 kD chitinase가, 대두에서는 30 kD와 36 kD chitinase가 뚜렷이 세포간극에 축적되었다. 스트레스 조건에서 시간이 경과함에 따라 이들의 세포간극에 축적되는 양은 많아졌다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제7권1호
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• pp.38-42
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• 2002

A chitinase gene (pCHi58) encoding a 58 kDa chitinase was isolated from the Serratia marcescens KCTC 2172 cosmid library. The chitinase gene consisted of a 1686 bp open reading frame that encoded 562 amino acids. Escherichia coil harboring the pChi58 gene secreted a 58 kDa chitinase into the culture supernatant. The 58 kDa chitinase was purified using a chitin affinity column and mono-S column. A nucleotide and N-terminal amino acid sequence analysis showed that the 58 kDa chitinase had a leader peptide consisting of 23 amino acids which was cleaved prior to the 24th alanine. The 58 KDa chitinase exhibited a $98\%$ similarity to that of S. marcescens OMB 1466 in its nuclotide sequence. The chitinolytic patterns of the 58 kDa chitinase released N,N'-diacetyl chitobiose (NAG2) as the major hydrolysis end-product with a trace amount of N-acetylglucosamine. When a 4-methylumbellyferyl-N-acetylglucosamin monomer, dimmer, and tetramer were used as substrates, the 58 kDa chitinase did not digest the 4-Mu-NAG monomer $(analogue\;of\;NAG_2)$, thereby indicating that the 58 kDa chitinase was likely an endochitinase. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were $50^{\circ}C$ and 5.0, respectively.

• Applied Biological Chemistry
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• 제37권1호
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• pp.49-55
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• 1994

벼잎의 산성용액 추출물로부터 ion exchange chromatography chitin affinity chromatography chromatofocusing gel slicing 등의 방법으로 단백질 RCG-2를 순수분리하였다. 본 단백질은 chitin과 laminarin을 가수분해하므로 chitinase와 ${\beta}-1,3-glucanase$ 활성을 함께 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 이외에도 M. lysodeiktikus cell wall을 가수분해하는 lysozyme 활성도 보유하는 것으로 판명되었다. 분자량이 29.77 kd인 본 효소의 chitinase 활성은 pH 4.0에서, ${\beta}-1,3-glucanase$ 활성은 pH 7.0에서 최대로 나타났고, 최적온도는 두 효소 활성 모두 $40^{\circ}C$ 이었다. chitin에 대한 $K_M$ 값은 7.86 mM, $V_{max}$는 $0.025\;{\mu}M/min$, laminarin $({\beta}-1,3-glucan)$에 대한 것은 각각 5.95 mM, $0.16{\mu}\;M/min.$ 이었으며, 정제된 효소는 chitin을 chitooligosaccharide로 분해하는 것으로 나타나서 endochitinase로 판명되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제35권3호
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• pp.191-195
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• 1992

강낭콩 잎에서 에틸랜에 의하여 유도되는 분자량 30KD인 염기성 키틴분해효소를 정제하고 그 항균활성을 연구하였다. 이 단백질은 chitinase 활성과 lysozyme 활성을 가졌으며, Aspergillus fumigatus, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani의 균사 생장을 억제하였다. 그러나 함께 실험한 2종류의 미생물 chitinase, 달걀 lysozyme, 파파야 protease는 이들에 대한 항균작용을 갖지 않았다. 이상의 결과는 lysozyme 활성을 가진 식물 chitinase가 병원균의 균사생장을 억제하여 자신을 방어할 수 있음을 시사한다.