• 미생물학회지
• /
• 제55권3호
• /
• pp.181-190
• /
• 2019

대장균 세포분열 조절에 관여하는 DicA 단백질은 $37^{\circ}C$보다 $25^{\circ}C$에서 DNA에 더욱 잘 결합한다. 그러나 DicA 단백질의 온도의존적 DNA 결합에 대한 분자적 원인은 명확하지 않다. 본 연구에서는 DicA 단백질이 어떻게 DNA에 결합하며, 왜 온도 의존적 결합양상을 보이는지 알아보았다. In vivo DNA 결합 분석 결과 RovA나 SlyA와 같은 DicA의 상동성 단백질과는 달리 DicA는 N 말단에 있는 DNA 결합 도메인을 이용하여 20개의 염기쌍으로 이루어진 dicC 조절자 유전자(Oc)에 결합함을 보여주었다. 또한 in vivo 실험에서 DicA는 $37^{\circ}C$ 보다 $25^{\circ}C$에서 DNA에 더 잘 결합하는 것으로 알려진 Cnu 또는 H-NS의 영향을 받지 않고 자체적으로 Oc에서의 온도 의존적 DNA 결합을 보인다. 하지만 정제된 DicA 단백질을 이용한 in vitro binding 실험에서는 온도 의존적 DNA 결합이 관찰되지 않았다. Crude 단백질을 이용한 실험에서 DicA 단백질의 온도 의존적 DNA 결합이 관찰되는 것으로 보아 DicA의 온도 의존적 DNA (Oc) 결합은 crude 단백질내에 존재하는 아직 알려지지 않은 in vivo factor에 의해 일어난다.

• 생명과학회지
• /
• 제15권3호
• /
• pp.439-446
• /
• 2005

페리틴은 생체 내 주요 철 저장 단백질로서 포유류에서 세균류에 이르기까지 다양한 생명체에 존재한다. 페리틴 분자는 $18\~22 kDa$의 단량체 24개가 결합된 약 240 kDa분자량을 지닌 거대분자이다. 본 연구에서는 개의 비장에서부터 열처리, 염석, 컬럼 크로마토그래피, 그리고 한외여과 등의 방법으로 페리틴을 정제한 후, 그 전기영동상의 특성 및 면역화학적 특성을 말, 소, 돼지 등의 비장 유래 페리틴과 비교 분석하였다. 이러한 정제방법에 의해 개의 비장으로부터 페리틴의 양은 비장 1g당 약$84{\mu}g$이었다. 정제된 개 페리틴의 철 함량은 $22.7\%$로서 함께 비교 검토한 다른 동물 유래의 페리틴에 비해 가장 높게 나타났다. 개 페리틴의 비변성 겔에서의 이동상은 소페리틴과 유사하였고, 변성 겔에서는 돼지 및 말의 페리틴과 유사하였다. SDS-PACE상에서 나타난 개 페리틴 subunit의 분자량은 19.5kDa이였으며 이때 SDS-PACE상의 ferritin subunit은 철과 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 개 페리틴의 면역화학적 특성을 다른 동물유래의 페리틴과 비교하고자, 개의 페리틴에 대한 다클론 항체를 쥐에서 생산하였다. 생산된 항-페리틴 항체를 이용하여 Ouchterlony doulbe immunodiffusion방법으로 개, 소, 말, 돼지 페리틴들을 항원으로 항원-항체반응을 조사한 결과, 항-개 페리틴 항체가 소, 말, 돼지의 페리틴과도 항원-항체반응을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다. 이는 개, 소, 말, 돼지 페리틴들이 항원적 동일성을 지니고 있음을 시사한다. 항-개 페리틴 항체를 이용하여 타 동물 유래의 페리틴에 대한 Western blot analysis를 시도한 결과, 항-개 페리틴 항체가 개 페리틴 및 돼지 폐리틴에는 강하게 반응하였으나 말과 소 유래의 페리틴에 대해서는 비교적 약하게 반응하여, 개의 페리틴이 면역화학적으로 돼지 페리틴과 가장 유사한 것으로 나타났다. 이상의 결과들은 개의 페리틴에 대한 생화학적 및 면역학적 특성을 제시한다.

• 한국잠사곤충학회지
• /
• 제25권2호
• /
• pp.1-31
• /
• 1984

가잠에 있어서 피해가 많은 전염성 연화병(Flacherie Virus; FV)과 농핵병 바이러스(Densonucleosis virus; DNV)의 증식에 관한 연구를 행하기 위하여 서당밀도 구배 초원심분리법에 의한 양바이러스의 정제 및 전자현미경에 의한 관찰, 바이러스 감염잠의 중장과 체액에서의 핵산과 단백질의 변동 및 감염중장 피막세포의 전자현미경에 의한 병리조직학적 관찰 등, 일연의 조사를 통하여 다음과 같은 연구결과를 얻었다. 1. 서당밀도구배에 의한 초원심분리법을 이용하여 FV 및 DNV를 분획한 결과, base line이 낮고 좌우상칭의 단일 peak를 나타내는 전형적인 바이러스 분획을 얻었으며, 또한 이들 바이러스의 negative 염색에 의한 전자현미경 관찰에서 FV는 27nm, DNV는 21nm의 균일한 구형입자임이 확인되었다. 2. 두 바이러스 감염잠의 체중은 바이러스 접종 6일 후부터, 중장중은 바이러스 접종 3일 후부터 건전잠에 비해 뚜렷한 감소를 나타냈다. 3. DNA의 양적 변화는 FV 및 DNV 감염잠에서 공히 중장에서는 전기간을 통해 건전잠에서 보다 높았고, 체액에서는 바이러스 접종 초ㆍ중기에는 큰 변화가 없고 바이러스 접종 7일 이후에는 건전잠에서 보다 훨씬 낮았다. 4. RNA의 양적 변화는 FV 및 DNV 감염잠에서 다같이 바이러스 접종 초기에 중장에서는 건전잠에 비해 높았고, 체액에서는 건전잠에 비해 매우 낮았으나, 바이러스 접종 말기에는 중장 및 체액의 경우 공히 건전잠에서 보다 현저히 낮았으며 그 정도는 DNV 감염잠에서 더 심했다. 5. FV 및 DNV 감염잠에서 중장과 체액의 단백질은 바이러스 접종 중기까지는 건전잠에 비해 큰 변화가 없었으나, 접종 말기에서는 건전잠에서 보다 월등히 낮았다. 6. 바이러스 접종 8일 후의 FV 및 DNV 감염잠 중장 RNA 전기영동상은 건전잠의 중장 RNA인 26S, 17S, 5S 및 4S의 4종 band와 동일했다. 7. FV 및 DNV 감염잠의 중장 단백질 전기영동상은 바이러스 접종 1일과 5일 후에는 건전잠의 것과 큰 차이가 없고, 접종 8일 후에는 건전잠에 존재하는 이동도가 낮은 L band가 양 바이러스 감염잠에서는 공히 소실되는 반면, 건전잠에서 볼 수 없는 이동도가 중간인 M band가 새로이 나타났으며 비교적 이동도가 높은 건전잠의 N band는 양 바이러스 감염잠에서는 2개로 분리되었다. 8. 체액단백질의 전기영동상은 FV 및 DNV감염잠 공히 건전잠의 것과 유사하나, 바이러스 접종 8일 후에는 양적인 감소를 나타내어 건전잠의 약 40%에 지나지 않았다. 9. FV 감염중장조직을 pyronin-methyl green 2종 염색을 하여 광학현미경으로 관찰한 결과, 바이러스 접종 8일 후의 중장원동세포내에서 A형 및 B형 봉입체가 형성되었음을 확인하였다. 10. FV감염 중장조직세포의 전자현미경 관찰에서는 바이러스 접종 5일 후에 배상세포의 'cytoplasmic wall'이 비대해지고 그 내부에 virus-specific vesicle이 형성되었으며, 바이러스 접종 8일 후에는 virus-specific vesicle, 바이러스 입자, linear structure, tubular structure 및 전자밀도가 높은 matrix 등의 바이러스 감염에 대한 특이적인 구조물이 배상세포의 세포질에서 관찰되었으며, microvilli내에서 바이러스 입자의 존재도 확정되었다. 특히 virus-specific vesicle 주위에서는 전자밀도가 높은 구형의 바이러스 입자 유사체가 관찰되었는데, 이것은 virus-specific vesicle 주위에서 바이러스 조립이 일어나는 것을 추정된다. 한편 원통세포 내에서 봉입체 관찰되고, 변형소구화된 배상세포가 중장강으로 탈락되는 것이 관찰되었다. 11. DNV감염 중장조직을 acridine orange 염색을 하여 형광현미경으로 관찰한 결과, DNV접종 5일 후에 본 바이러스 증식 장소인 원동세포핵의 비대가 뚜렷이 관찰되었다. 12. 전자현미경에 의해 DNV감염 중장조직세포를 관찰한 결과, 바이러스 접종 5일 후에 원동세포 핵내의 인이 소형 과립으로 붕괴되어 산재되었고, 접종 8일후에는 전자밀도가 높은 virogenic stroma가 출현하였으며, 감염 말기로 추정되는 핵내의 전자밀도가 전자보다 낮고 더욱 확대되어 핵의 대부분을 차지하는 virogenic stroma도 관찰되었다. 또한 이들 virogenic stroma내에서 바이러스 입자유사체가 관찰되는 것으로 보아 이 virogenic stroma는 바이러스 전구물질의 합성 및 바이러스 조립장소임을 시사하고 있다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제52권5호
• /
• pp.485-496
• /
• 2002

연구배경 : Nuclear factor ${\kappa}B$ (NF-${\kappa}B$)는 면역기능, 급성기 반응, 세포주기 조절 등 다양한 세포활동을 조절하는 전사인자로서 외부 자극에 의해 세포질에 존재하던 NF-${\kappa}B$가 핵 속으로 이동되어 여러 유전자의 ${\kappa}B$ element에 결합하여 그 유전자의 전사를 가져온다. 최근 들어 암의 발생과 증식 및 전이에 있어 NF-${\kappa}B$의 역할이 주목받고 있다. 즉, 여러 종류의 암세포에서 NF-${\kappa}B$의 과발현 및 지속적인 활성화가 알려져 NF-${\kappa}B$와 암의 발생 및 증식과의 관련성이 제시되고 있고, NF-${\kappa}B$의 항 아포프토시스 기능은 암세포의 생존에서 중요한 역할을 하는 것으로 이해되고 있다. 또한 ICAM-l, VCAM-l 등 세포 부착물질의 발현에 영향을 끼쳐 암 전이와의 관련성도 제시되고 있다. 폐암에서 NF-${\kappa}B$의 역할에 관한 연구는 많지 않은 상태로 폐암 조직 및 폐암 세포주에서 p50과 c-Rel의 과발현이 보고된 바 있다. 그러나 NF-${\kappa}B$의 과발현이 NF-${\kappa}B$의 활성화를 의미하는 것은 아니며 현재까지 폐암 세포에서 NF-${\kappa}B$의 활성화 유무에 관한 연구는 없는 실정이다. 방 법 : 본 연구에서는 정상 기관지 세포주와 폐암 세포주에서 기저 상태와 외부 자극에 의한 NF-${\kappa}B$의 활성화를 비교하여 폐암 세포에서 NF-${\kappa}B$의 활성도를 평가하였다. 정상 기관지 상피세포로는 BEAS-2B 세포주를 사용하였고 폐암 세포주로는 A549, NCI-H358, NCI-H441, NCI-H522, NCI-H2009, NCI-H460, NCI-H1229, NCI-H1703, NCI-H157, NCI-H187, NCI-H417, NCI-H526 등 12종을 실험에 사용하였다. NF-${\kappa}B$의 활성화는 p65와 p50의 핵내 발현과 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 이용한 NF-${\kappa}B$ DNA binding activity로 평가하였다. 결 과 : NCI-H358과 NCI-H460 세포를 제외한 모든 폐암 세포주와 BEAS-2B 세포의 기저상태에서 핵 단백질내에 p65와 p50의 발현이 관찰되었다. TNF-$\alpha$로 자극하고 30분이 경과한 후에는 핵 내 p65와 p50의 발현이 증가하였다. NCI-H358과 NCI-H460 세포에서는 기저 상태와 TNF-${\alpha}$ 자극 시 핵 단백질 내의 p65의 발현이 관찰되지 않았고 TNF-${\alpha}$ 자극했을 때에도 p65의 발현은 증가하지 않았다. 그러나 이 두 세포주에서는 TNF-${\alpha}$로 자극 시 p50보다 분자량이 작은 두 종의 단백질의 발현이 증가되어 p50의 변형된 형태로 생각되었다. 기저 상태에서의 NF-${\kappa}B$의 DNA 결합능은 실험에 사용한 모든 세포주에서 거의 관찰되지 않았고 TNF-${\alpha}$ 자극 시 유의하게 증가하였다. TNF-${\alpha}$ 자극으로 활성화된 NF-${\kappa}B$ complex는 NCI-H358 과 NCI-H460을 제외한 모든 세포주에서는 p50/p65 heterodimer로 확인되었고 NCI-H358과 NCI-H460에서는 변형된 p50/p50 homodimer가 활성화되었다. 결 론 : 이상의 결과로 일부 폐암 세포주에서 외부 자극으로 활성화된 NF-${\kappa}B$ complex의 구성에 차이를 보였지만 전체적으로는 정상 기관지 세포주와 비교해 폐암 세포해서 NF-${\kappa}B$ 활성화에 있어 큰 차이가 없었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제53권5호
• /
• pp.519-529
• /
• 2002

연구배경 : 급성폐손상의 치료로 시도되는 표면활성물질의 효과는 허탈된 폐포를 재환기시키는 작용 외에 표면 활성물질 자제가 가지고 있는 항염증작용이 중요한 기전으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 백서의 급성폐손상 모델을 이용하여 기관 내로 표면활성물질을 투여하였을 때, 기관지폐포세척액의 백혈구수와, 염증매개 사이토카인인 IL-$1{\beta}$ 그리고 IL-6의 농도에 변화가 있는지를 살펴보고, surfactant의 항염증작용이 전사인자인 NF-${\kappa}B$의 활성의 억제를 통하여 이루어지는지 여부를 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 법으로 확인하였다. 방 법 : 대상동물은 300g 내외의 수컷 백서를 이용하였으며, 대상동물을 각각 6 마리씩 세 군으로 나누었다. 대조군은 기관 내로 생리식염수(3ml/kg)를 30분 간격으로 투여하였다. 나머지 두 군은 기관 내로 내독소(5mg/kg)를 투여하여 급성폐손상을 유발하고, 30 분 후에 표변활성 물질 치료군은 surfactant(30mg/kg)을 그리고 비치료군은 생리식염수(3ml/kg)을 각각 기관 내로 투여하였다. 생리식염수나 내독소를 투여한 24 시간 후에 기관지폐포세척술을 시행하였고, 기관지폐포세척액 내의 백혈구수와 IL-$1{\beta}$ 그리고 IL-6의 농도를 측정하였다. 또한 기관지폐포세척액에서 호중구를 분리하고 핵 단백질을 추출하여 NF-${\kappa}B$의 활성을 EMSA법으로 측정하였다. 결 과 : 대조군, 표면활성물질 치료군, 그리고 비치료군의 기관지폐포세척액의 백혈구 수는 각각 $356{\pm}275{\times}10^3/{\mu}1$, $3,221{\pm}1,914{\times}10^3/{\mu}1$, 그리고 $5,561{\pm}1,757{\times}10^3/{\mu}l$으로 비치료군의 백혈구 수가 가장 높았고, 다음으로 표면활성물질 치료군, 비치료군의 순서였다(p<0.05). 기관지폐포세척액의 IL-$1{\beta}$ 농도는 대조군은 0pg/ml, 표면활성물질 치료군은 $360{\pm}234pg/ml$, 그리고 비치료군은 $2,064{\pm}1,082pg/ml$로 대조군에 비해 표면활성물질 치료군이, 그리고 표면활성물질 치료군에 비해 비치료군의 IL-$1{\beta}$농도가 높았다(p<0.05). 기관지폐포세척액의 IL-6 농도는 대조군, 표면활성물질 치료군, 비치료군에서 각각 $49{\pm}62pg/ml$, $1,754{\pm}1,340pg/ml$, 그리고 $3,621{\pm}567pg/ml$으로 대조군에 비해 표면활성물질 치료군이, 그리고 표면활성물질 치료군에 비해 비치료군의 농도가 높았다(p<0.05). 표면활성물질 치료군과 비치료군 사이에서 호중구의 NF-${\kappa}B$ 활성화에는 차이가 없었다. 결 론 : 이상의 연구로 내독소의 기관 내 투여로 유발한 백서의 급성폐손상에서 기관 내로 투여한 표면활성물질은 기관지폐포세척액의 백혈구수와 염증매개 사이토카인인 IL-$1{\kappa}$ 그리고 IL-6의 농도를 감소시켜 폐포 내의 염증을 감소시켰으며, 표면활성 물질의 항염증작용은 NF-${\kappa}B$의 활성의 억제를 통하여 이루어지지는 않는 것으로 판단된다.

• Molecules and Cells
• /
• 제37권2호
• /
• pp.178-186
• /
• 2014

Differential transcription of the clusterin (CLU) gene yields two CLU isoforms, a nuclear form (nCLU) and a secretory form (sCLU), which play crucial roles in prostate tumorigenesis. Pro-apoptotic nCLU and anti-apoptotic sCLU have opposite effects and are differentially expressed in normal and cancer cells; however, their regulatory mechanisms at the transcriptional level are not yet known. Here, we examined the transcriptional regulation of nCLU in response to hypoxia. We identified three putative hypoxia response elements (HREs) in the human CLU promoter between positions -806 and +51 bp. Using a luciferase reporter, electrophoretic gel mobility shift, and chromatin immunoprecipitation assays, we further showed that hypoxia-inducible factor-$1{\alpha}$ (HIF-$1{\alpha}$) bound directly to these sites and activated transcription. Exposure to the hypoxia-mimetic compound $CoCl_2$, incubation under 1% $O_2$ conditions, or overexpression of HIF-$1{\alpha}$ enhanced nCLU expression and induced apoptosis in human prostate cancer PC3M cells. However, LNCaP prostate cancer cells were resistant to hypoxia-induced cell death. Methylation-specific PCR analysis revealed that the CLU promoter in PC3M cells was not methylated; in contrast, the CLU promoter in LNCap cells was methylated. Co-treatment of LNCaP cells with $CoCl_2$ and a demethylating agent promoted apoptotic cell death through the induction of nCLU. We conclude that nCLU expression is regulated by direct binding of HIF-$1{\alpha}$ to HRE sites and is epigenetically controlled by methylation of its promoter region.

• Clinical and Experimental Pediatrics
• /
• 제45권9호
• /
• pp.1106-1113
• /
• 2002

목 적: 전사인자 $NF-{\kappa}B$는 스트레스 등으로부터 세포 자멸사를 조절하여 적응을 유지하는 기본적인 분자로 인식되고 있다. 저산소증 상태는 많은 심장병에서 동반되는 병변으로 성장인자 VEGF와 IGF-I는 저산소증 시에 심장을 보호하는 작용을 할 것으로 추측되고 있다. 본 연구에서는 저산소증과 같은 자극으로부터 심장의 보호 기능이 추정된 $NF-{\kappa}B$의 발현과 함께 VEGF와 IGF-I의 발현 연관성을 검토하여 분자 생물학적인 기전을 이해하고자 하였다. 방 법 : 실험동물로 Sprague Dawley rat을 이용하여, 저산소 자극은 8%의 산소와 92% 질소를 hypoxic chamber로 관류시키며 유도하였다. 심장에 대한 저산소증 자극 후 심근세포로부터 측정 인자들과 관련된 핵 내 단백질, 전단백질 그리고 mRNA를 분리하였다. 핵 내의 전사인자는 EMSA로 측정하였으며, VEGF와 IGF-I의 발현은 competitive-PCR, Western hybridization, Northern hybridization으로 확인하였다. 또한 이러한 성장인자의 발현과 관련된 $NF-{\kappa}B$의 기능을 확인하기 위하여 $NF-{\kappa}B$의 핵 내 이동 억제제인 DDTC를 전 처치로 복강 내 주사하여 그에 따른 VEGF 및 IGF-I의 발현 양상을 비교하였다. 결 과 : 저산소 자극 후에 심근 세포 내에 전사인자 $NF-{\kappa}B$, AP-1, NF-ATc의 활성이 증가되었다. VEGF와 IGF-I의 발현도 저산소증 자극 시 증가되었지만, DDTC 전 처치에 의한 $NF-{\kappa}B$의 핵 내 이동 차단 후 이들 인자의 발현은 의의 있게 감소하였다. 결 론 : 전사인자 $NF-{\kappa}B$는 저산소증 상태에서 그 활성이 증가하고 저산소증 상태와 같은 심장에 대한 이상 자극 시 VEGF와 IGF-I의 발현을 증가시켜 심장을 보호하는 것으로 추정된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제54권5호
• /
• pp.551-562
• /
• 2003

연구배경 : NF-${\kappa}B$는 많은 염증 유발성 물질들을 발현시키는데 필요한 전사 인자로서, 염증성 폐질환 발병에 관여한다는 사실이 확인되었다. 이러한 NF-${\kappa}B$의 활성화에는 여러 신호전달 체계가 관여한다는 사실이 밝혀지고 있으며 최근 PI3K/Akt 경로도 NF-${\kappa}B$ 활성화에 관여한다는 연구 결과가 보고되고 있으나, 실험 대상 세포주마다 활성화 기전이 다르고 호흡기 상피세포에 대한 결과도 알려져 있지 않아 호흡기 상피세포에서의 NF-${\kappa}B$ 활성화에 PI3K/Akt 경로가 관여하는지를 밝히기 위하여 본 연구를 시행하게 되었다. 방법 : 인체 기관지 상피세포주인 BEAS-2B와 폐암 세포주인 A549, NCI-H157을 사용하여 Akt 활성화와 $I{\kappa}B{\alpha}$ 분해 여부를 확인하기 위해 western blot을 시행하였다. Wortmannin, LY294002 및 DN-Akt를 이용하여 Akt 경로를 억제하였고, NF-${\kappa}B$ 활성화와 전사 활성을 측정하기 위하여 각각 EMSA와 luciferase assay를 시행하였다. 결과 : BEAS-2B, A549 및 NCI-H157 세포주에 TNF-$\alpha$ 및 insulin을 처리한 경우 Akt 활성화가 유도되었다. Insulin 으로 Akt 경로를 활성화시킨 경우 $I{\kappa}B{\alpha}$ 분해가 일어나지는 않았다. Wortmannin, LY294002 및 DN-Akt 를 이용하여 Akt 경로를 억제한 경우 TNF-$\alpha$에 의한 $I{\kappa}B{\alpha}$ 분해 및 IKK 활성화가 억제되지는 않았으며, NF-${\kappa}B$ 활성화도 억제되지 않았다. Wortmannin을 처리한 경우 TNF-$\alpha$에 의한 NF-${\kappa}B$ 전사 활성이 오히려 증가하는 양상을 보였으나, DN-Akt 이입시킨 경우에는 관찰되지 않았다. 결론 : 인체 호흡기 상피세포에서는 $I{\kappa}B$/NF-${\kappa}B$ 경로의 활성화는 PI3K/Akt 경로와 무관한 것으로 판단된다.