틸라피아에 실험적으로 Edwardsiella tarda를 경구감염 시켰다. 틸라피아의 장을 자극시키지 않았을 때는 E. tarda가 감염되지 않았으나 과산화수소로 장을 자극시킨후 E. tarda를 투여하였더니 감염되었다. 150~200g되는 틸라피아 한마리에 $10^6CFU/m{\ell}$, $10^7CFU/m{\ell}$, $10^8CFU/m{\ell}$를 투여한 4일 후부터 죽은 실험어의 간장, 신장, 비장에 농창이 형성되었다. 또한 장관 장해부에서 세균이 증식되어 전신감염으로 급히 발병되어 죽은 예가 많았다. 자연감염어에서 볼 수 있는 증상이 나타났다.
어류의 감염 조직으로부터 edwardsiellosis의 원인균인 Edwardsiella tarda를 whole cell 자체로 직접 검출할 수 있는 solid phase ELISA법을 연구하였다. A. hydrophila ATCC7966, V. anguillarum HUFP5001, Y. ruckeri 11-4, E. ictaluri 및 Streptococcus sp. NG8206 등의 어병세균에 대해 ELISA법으로 실시한 교차반응 분석에서 A. hydrophila ATCC7966 균주와 V. anguillarum HUFP5001 균주가 E. tarda Edk-2에 대한 토끼 항혈청에 대해 높은 교차반응을 나타내었으나, 항혈청을 A. hydrophila ATCC7966 FKC로 흡착시킴으로써 교차반응을 제거할 수가 있었다. 그러나, 응집항체가 측정 결과와는 달리, ELISA 분석에서는 E. tarda 분리 균주간의 교차반응이 매우 높은 것으로 나타났다. Tissue homogenate내에 있는 항원을 검출함에 있어, 조직내의 지질이나 단백질 성분이 함께 분석용 plate에 coating되어 감도가 훨씬 감소하므로 ELISA법의 적용을 위해서는 감염 조직의 homogenate를 PBS에 100배 이상 희석한 후 진단을 실시해야 하는 것으로 나타났다. Tissue homogenate내에 있는 생균을 항원으로 하여 직접 검출할 때에는 검출한계가 $1{\times}10^3$ cells/ml로 나타나 FKC 항원의 사용에 비하여 더 증가된 감도를 보여주었다. 결론적으로 본 ELISA법은 양식장에서 발생한 edwardsiellosis를 진단함에 있어서 특이적이고 신속하며 민감한 방법으로 확인되었다.
본 연구는 tilapia의 Edwardsiella tarda균체 항원(FKC)에 대한 항원성을 증가시키고, 백신의 투여 효과를 지속시키기 위해 백신을 3종류의 adjuvant 즉 FCA, FIA 및 PAS에 혼합하여 사용했을 때와 adjuvant만을 사용했을 때 그리고 E. tarda의 FKC를 투여 했을 때의 효과를 비교 조사하고자 하였다. Microtiter법에 의해 응집 항체가의 지속성을 측정하였고, 공격 시험에 대한 방어 효과는 E. tarda T1123균주의 농도별에 따른 상대 생존율(RPS)로서 판정하였다. 3종류의 adjuvant에 혼합시킨 백신 실험구는 FKC 단독 투여 실험구에 비하여 8주째 높은 응집 항체가를 지속시켰다. 가장 높은 응집 항체가는 2주째 FCA+FKC, PAS+FKC 및 FKC 실험구에서 나타났다. 상대 생존율이 60이상으로 나타난 실험구는 면역 처리 후 3주째 $2.5{\times}10^7\;CFU/ml$와 $2.5{\times}10^8\;CFU/ml$ 농도로서 공격 시험한 FCA+FKC, PAS+FKC 및 FKC 실험구와 8주째 $2.5{\times}10^7\;CFU/ml$ 농도로서 공격 시험한 FCA+FKC 및 PAS+FKC 실험구 이었다. Adjuvant만으로 면역 처리한 Tilapia의 E. tarda에 대한 저항성은 대조구보다 다소 높은 것으로 나타났다. Tilapia의 에드와드병에 대한 백신의 adjuvant로서 FCA와 PAS는 백신 효과를 장기간 지속시켜 방어력을 증강시킨 것으로 나타났다.
본 연구에서는 양식 넙치의 주요 어병세균인 E. tarda, V. ichthyoenteri와 S. iniae에 대한 국내산 꿀벌로부터 분리한 봉독의 항균활성을 검색하였다. 그 결과 봉독은 폐사 납치로부터 분리한 그람음성균인 E. tarda, V. ichthyoenteri와 양성균인 S. iniae 모두에서 강한 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 봉독은 E. tarda와 V. ichthyoenteri에 대하여 최소발육저지 농도는 각각 17.6 ${\mu}g$/ml, 1.76 ${\mu}g$/ml 였으며, 최소살균 농도는 34.6 ${\mu}g$/ml, 6.8 ${\mu}g$/ml, 항균력 지속시간은 5시간, 6시간으로 측정되었다. 또한 그람 양성균인 S. iniae에 대한 최소발육저지농도는 3.49 ${\mu}g$/ml, 최소살균농도는 11 ${\mu}g$/ml였으며, 항균력지속시간은 7시간으로 봉독은 매우 강한 증식 및 살균 억제력을 보였다. 뿐만 아니라, 다양한 pH 조건하에서도 향균활성이 유지되는 것으로 확인되었다.
산화된 사료에 첨가한 비타민 E, C 와 glycyrrhizin이 나일 틸라피아의 성장 및 Edwardsiella tarda 감염 시 저항력에 미치는 영향을 알아 보기 위해 thiobarbitric acid (TBA) 값이 $80\~88$ mg/kg 사료만을 단독으로 또는 이 사료 100 g 당 비타민 E (50 mg), C (60 mg)과 glycyrrhizin ($25\~200$ mg) 등을 각기 또는 상호 혼합하여 7 주간 사육하였다. 사육후 성장을 조사한 결과 비타민 E, C 및 glycyrrhizin 등을 각기 또는 혼합한 실험군이 산화된 사료만을 투여한 대조군에 비해 성장율이 좋았으며, 혈청 내의 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)와 glutamic pyruvic transaminase (GPT) 값은 산화된 사료를 투여한 실험군에서만 매우 높게 나타났다. 질병원인 E. tarda를 인위적으로 감염시켰을 때 저항력에 있어서도 glycyrrhizin 25 mg 투여군을 제외한 비타민 E, C 및 glycyrrhizin 등을 투여한 실험군이 산화된 사료만을 투여한 대조군에 비해 생존율이 현저히 높았다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 산화된 사료만을 나일 틸라피아에 투여했을 때 성장 및 간의 활성도가 떨어지는 반면, 비타민 E, C 및 glycyrrhizin 등을 섞어서 투여했을때 성장 및 간의 활성도가 증가되었을 뿐만 아니라 E. tarda에 대한 저항력도 증가되었음을 알 수 있었다.
어병 세균으로부터 분리된 R-plasmid의 특성과 그 DNA 구조는 Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, Edwardsiella tarda, Enterococcus seriolicida, Pasteurella piscicida, Vibrio onguillarum등 세균의 종류에 따라 다르다. 그러나 A. hydrophila와 E. tarda로부터 그리고 A. hydrophila와 A. salmonicida로부터 분리된 몇몇 R-plasmid는 같은 내성형을 가지면서 유사한 DNA 구조를 보였다, V. anguillarum에서 분리된 R-plasmid는 1977년 이전, 1980년과 1983년 사이 그리고 1989년과 1991년 사이에 분리된 것이 그 DNA 구조에 차이를 보여 각각 그룹 1, 2, 3으로 구분되어졌다. P. piscicida의 경우에는 연도와 지역에 관계없이 동일한 DNA 구조를 갖는 R-plasmid가 분리되었다. Macrolide계 항생제(MLs), lincomycin(LM), tetracycline(TC) 그리고 MLs, LIM, chloramphenicol(CP) 내성을 나타내는 R-plasmid를 갖는 E. seriolicida가 각 지역의 Yellowtail 어장에 분포되어 있었다. P. piscicida의 R-plasmid에는 type I의 chloramphenicol acetyltransferase(CAT)에 의하여 CP 내성을 나타내는 유전자(cat)가, 그리고 E. tarda, A. salmonicida와 1980년 이후에 분리된 V. anguillarum의 R-plasmid에는 CAT type II에 해당하는 car 유전자가 분포되어 있었다. TC 내성 유전자(tet)의 경우에는 1977년 이전과 1980년 이후에 분리된 V. anguillarum으로부터 class B, G의 tet 유전자가 확인되었으나, E. tarda, P. piscicida, A. hydrophila 그리고 1989년 이후에 분리된 V. anguillarum등 어병세균의 R-plasmid에는 class D의 tet 유전자가 널리 분포하고 있는 것으로 나타났다.
넙치 병원성 세균에 대한 항균제 내성율과 다제내성을 조사하고자 연구를 수행하였다. 우리나라의 양식 넙치 (Paralichthys olivaceus)에서 161균주가 분리되었고 분리균주에는 Edwardsiella tarda (n=32), Vibrio ichthyoenteri (n=37), Vibrio spp. (n=54), Streptococcus parauberis (n=28) 그리고 Streptococcus spp. (n=10)가 포함되었다. E. tarda 분리균주는 tetracycline (84.4%)과 oxolinic acid (71.9%)에 높은 내성율을 나타내었고 V. ichthyoenteri와 Vibrio spp.는 ampicillin (94.6%, 81.5%)과 tetracycline (56.8%, 42.6%) 순서로 높은 내성율을 나타내었다. S. parauberis 분리균주는 ampicillin (57.1%), tetracycline (57.1%), erythromycin (35.7%) 순서로 높은 내성율을 보였다. E. tarda의 84.4%, V. ichthyoenteri의 73.0%, Vibrio spp.의 57.4%, S. parauberis의 42.8% 그리고 Streptococcus spp.의 70.0%가 2종류 이상의 항균제에 다제내성을 나타내었다.
어류의 면역반응에 대한 cadmium (Cd)의 영향을 분석하기 위하여 넙치 (Paralichthys olivaceus)를 각기 다른 방향으로 Cd에 노출시킨 후 특이적 면역반응의 변화와 Edrwrdsiella tarda KFE (E. tarda KFE)의 인위감염에 대한 저항성을 분석하였다. E. tarda KFE의 formalin killed cell (FKC)로 면역시키기 2주전부터 계속하여 실험 기간동안 침지법으로 Cd(20ppb)에 노출된 시험구는 노출되지 않은 시험구와 양성 대조구보다 혈청 내 특이 항체가가 빠르게 최고치에 이르렀으나, 감소속도는 노출시키지 않은 양성 대조구에 비하여 빠른 것으로 나타났다. 이러한 경향은 splenocytes를 ELISPOT-assay (enzyme-linked immunospot assay)를 이용하여 특이 항체 생성 세포 (specific antibody secreting cell, SASC) 수를 분석해 보았을 때에도 동일하게 나타났다. 그러나 면역 전 2주 동안만 Cd에 노출시킨 시험구에서는 혈청내 항체생성 결과와는 달리 증가된 SASC의 수를 보여 주었다. 그리고 면역 2주 전부터 실험 전기간동안 계속해서 Cd에 노출시킨 넙치를 대상으로 하여 E. tarda FKC 생균으로 인위 감염시켰을 때 100% 폐사율을 보여 주었다. 이것은 Cd에 지속적으로 노출된 어류에서의 방어 체계는 면역반응뿐만 아니라 독성효과도 함께 고려되어야 하는 복합적인 것임을 확인 할 수 있었다.
Min-Goo Seo;Kyung-Yeon Eo;Dongmi Kwak;Kyoo-Tae Kim
한국임상수의학회지
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제40권1호
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pp.78-82
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2023
Edwardsiella (E) tarda belongs to the Enterobacteriaceae family and is a motile, gram-negative, rod-shaped, facultative anaerobe regarded as an opportunistic and food-borne pathogen in animals and humans. A 21-year-old male Eurasian brown bear (Ursus arctos arctos) died suddenly without any preliminary signs. Necropsy performed according to standard protocol revealed swollen abdomen with hemorrhagic congestions of the gastroenteric organs, ascites, and hemorrhagic exudates around the mouth. The liver showed discoloration, along with a severely swollen and multiple hemorrhages of the spleen, an elongated gallbladder, and a congested cortex and medullar lesion of kidneys. The stomach contained semi-liquid exudates and undigested chicken exuding a decayed odor. The stomach membranes were dark-gray in color with several cysts in the fundus lesions. Rod-shaped bacteria were found in the major organs by Giemsa staining, identified as E. tarda using a biochemical rapid diagnostic identification kit.
In this study, a QCM biosensor was made to detect Edwardsiella tarda (E. tarda) using a specific antibody. A 9 MHz AT-cut piezoelectric wafer layered with two gold electrodes of 5mm diameter had a reproducibility of 0.1 Hz in frequency response and was used as the transducer of the QCM biosensor. Self assembled layer (SAM) was conformed on a quartz crystal by treating with 3-mer-captopropionic acid (MPA) and activated with N-ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The resulting NHS group was further converted to hydrazide by the reaction with hydrazine. Aldehyde group was introduced into the carbohydrate moiety of anti-E. tarda antibody by the reaction with periodic acid and was used to immobilise the antibody through the reaction with hydrazide group on the electrode surface. A baseline was established in the presence of phosphate-buffered saline (PBS) and a resonant frequency (F1) was measured. Sample was added to the sensor surface and second resonant frequency (F2) was measured after unbound substances were washed out with PBS several times. Finally, the frequency shift (ΔF) representing the mass change was calculated by subtracting F2 from F1. After adding the oxidized anti-E. tarda antibody to the electrode surface containing hydrazide group, frequency shift of 288.811.4 Hz (mean S.E) was observed, thus proving that considerable amount of antibody was immobilized. In the immunoassay test, the frequency shift of 1877.75 Hz, 580.67 Hz, 221.39 Hz, 7.671.83 Hz (mean S.E) were observed at doses of 1000, 500, 100, 50 g of bacterial cells, respectively. It was also demonstrated that the prepared sensor chip was stable enough to withstand repeated surface regeneration with 0.2 M Tris-glycine and 1 % DMSO, pH 2.3 more than ten times.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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