• 미생물학회지
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• 제48권2호
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• pp.73-78
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• 2012

본 연구자들은 이전에 cellulase, xyalnase 및 lichenase의 다기능 효소활성을 지니는 절단된 Cel44C-$Man26A_{P558}$의 ${\beta}$-glycosyl hydrolase를 보고하였다. 본 연구에서는 절단된 Cel44C-$Man26A_{P558}$ 효소의 다기능성 ${\beta}$-glycosyl hydrolase 활성을 증가시키기 위해 DNA shuffling을 시도하였다. DNA shuffling에 의해 단일변이(P438A)를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$와 이중변이(A273T 및 P438A)를 가진 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$를 얻었다. 이중변이를 가진 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$은 단일변이를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$ 보다 효소활성이 낮게 나타났으나, M2Cel44C-$Man26A_{P558}$와 M21Cel44C-$Man26A_{P558}$은 대조구인 Cel44C-$Man26A_{P558}$ 보다 약 1.3에서 2.2배 정도 높은 효소활성을 나타내었다. 특히, 단일변이를 가진 M2Cel44C-$Man26A_{P558}$는 대조구인 Cel44C-$Man26A_{P558}$보다 cellulase, xylanase 및 lichenase 효소활성이 약 1.5에서 2.2배 정도 높게 나타났다. ${\beta}$-Glycosyl hydrolase의 cellulase, linchenase 및 xylanase 최적 효소활성은 각각 pH 7.0, 7.0 및 6.0에서 이었다. 이러한 결과는, 아미노산 잔기인 Ala438이 다기능성 ${\beta}$-glycosyl hydrolase 활성을 증가시키는 중요한 역할을 한다고 추정할 수 있다.

• 한국정보과학회:학술대회논문집
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• 한국정보과학회 2004년도 봄 학술발표논문집 Vol.31 No.1 (B)
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• pp.265-267
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• 2004

생명체의 기본 정보가 저장된 DNA에서 생성되는 단백질은 생명 현상의 중요한 기능적 역할을 수행하기 때문에 단백질과 관련된 다양한 연구가 진행되고 있다. 본 논문에서는 단백질간 상호작용(protein-protein interaction)을 예측하기 위해 시스템을 통계학적 모델인 Support Vector Machine(SVM)을 사용하였다. SVM 시스템은 상호작용이 있는 데이터(긍정예제)와 상호작용이 없는 데이터(부정예제)를 입력으로 하여 모델링 생성과 테스트를 하는데, 상호작용이 있는 데이터는 DIP에 있는 interaction list로 해결이 가능하지만 상호작용이 없는 데이터는 현재 존재하지 않기 때문에 이를 생성하기 위한 생성방법이 필요하다. 이 논문에서는 shuffling, non-interaction list, 그리고 앞의 두 방법을 보완하는 non-interaction list ＋ shuffling이라는 방법을 제시하고 기존의 실험 결과를 상회하는 부정예제 생성방법을 제시한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권6호
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• pp.764-769
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• 2000

The lipase gene(lip) from Bacillus stearothermophilus was recombined in vitro by utilizing the DNA shuffling technique. After four rounds of shuffling, transformation, and screening based on the initial rate of clear zone formation on a tricaprylin plate, a clone (M10) was isolated, the cell extract of which showed about 2.8-fold increased lipase activity. The DNA sequence of the mutant lipase gene (m10) showed 3 base changes, resulting in two cryptic mutations and one amino acid substitution: S113($AGC{\rightarrow}AGT$), L252 ($TTG{\rightarrow}TTA$), and G275E ($GGA{\rightarrow}GAA$). SDS-PAGE analysis revealed that the increased enzyme activity observed in M10 was partly caused by high expression of the m10 lipase gene. The amount of the expressed G275E lipase was estimated to comprise as much as 41% of the total soluble proteins of the cell. The maximum velocity ($V_{max}$) of the purified mutant enzyme for the hydrolysis of olive oil was measured to be 3,200 U/mg, which was 10% higher than that of the parental (WT) lipase (2,900 U/mg). Its optimum temperature for the hydrolysis of olive oil was $68^{\circ}C$ and it showed a typical $Ca^{2+}$-dependent thermostability, properties fo which were the same as those of the WT lipase. However, the mutant enzyme exhibited a high enantiospecificity towards (S)-naproxen compared with the WT lipase. In addition, it showed increased hydrolytic activity towards triolein, tricaprin, tricaprylin, and tricaproin.

• 한국지하수토양환경학회:학술대회논문집
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• 한국지하수토양환경학회 2004년도 임시총회 및 추계학술발표회
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• pp.277-280
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• 2004

TCE and PCE, suspected carcinogens, are the most common groundwater pollutant from extensive use as a solvent and degreaser. Escherichia coli TGI pBSKAN TOM Green and E. coli TGI pBSKAN ToMO, which were used DNA shuffling technique, produce Toluene-o-monooxygenase(TOM) and toluene-o-xylene- monooxygenase(ToMO). These cells and enzymes are degrading TCE and PCE, TOM and ToMO are needed to cofactor, such as NADH, NADPH and other cofactors. Used TCE and PCE degrading microorganisms experiment the contaminated material removal efficiency. A shunting test used NAD and Hydrogen peroxide.

• KSBB Journal
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• 제21권5호
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• pp.394-400
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• 2006

이 연구의 최종 목표는 방향성 분자진화기술(directed molecular evolution)을 이용한 음이온에 안정한 papain의 개발이다. 음이온 안정성 papain 생산을 위한 유전자의 방향성 분자진화 방법 개발이 이루어졌으며 분자진화된 음이온 안정성 papain의 스크리닝 방법 개발됐다. 분자진화된 papain의 아미노산 서열 및 특성 분석과 분자진화된 재조합 papain의 생산방법 확립되었다. 분자진화된 재조합 papain의 formulation 및 제품 적용화 기술 개발이다. 연구 결과 Papain petidase IV 유전자의 확보 및 발현 균주 개발하였고 음이온 안정성 papain 유전자를 얻기 위한 분자진화의 방법 개발 및 조건 확립하였다. 분자진화 방법으로 error prone PCR 방법 확립, DNA shuffling을 통한 mutagenesis 방법 확립, staggered extension process 방법 확립 및 분자 진화된 음이온성 안정성 papain의 효율적 스크리닝 방법 개발하였다. Skim milk agar plate 이용, 활성 및 안정성이 뛰어난 개량형 papain을 Filter paper방법을 이용하여 screening 방법을 개발하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제32권11호
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• pp.1471-1478
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• 2022

2'-Fucosyllactose (2'-FL), the most abundant fucosylated oligosaccharide in human milk, has multiple beneficial effects on human health. However, its biosynthesis by metabolically engineered Escherichia coli is often hampered owing to the insolubility and instability of α-1,2-fucosyltransferase (the rate-limiting enzyme). In this study, we aimed to enhance 2'-FL production by increasing the expression of soluble α-1,2-fucosyltransferase from Helicobacter pylori (FucT2). Because structural information regarding FucT2 has not been unveiled, we decided to improve the expression of soluble FucT2 in E. coli via directed evolution using a protein solubility biosensor that links protein solubility to antimicrobial resistance. For such a system to be viable, the activity of kanamycin resistance protein (Kan^R) should be dependent on FucT2 solubility. Kan^R was fused to the C-terminus of mutant libraries of FucT2, which were generated using a combination of error-prone PCR and DNA shuffling. Notably, one round of the directed evolution process, which consisted of mutant library generation and selection based on kanamycin resistance, resulted in a significant increase in the expression level of soluble FucT2. As a result, a batch fermentation with the ΔL M15 pBCGW strain, expressing the FucT2 mutant (F#1-5) isolated from the first round of the directed evolution process, resulted in the production of 0.31 g/l 2'-FL with a yield of 0.22 g 2'-FL/g lactose, showing 1.72- and 1.51-fold increase in the titer and yield, respectively, compared to those of the control strain. The simple and powerful method developed in this study could be applied to enhance the solubility of other unstable enzymes.

• KSBB Journal
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• 제22권1호
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• pp.16-21
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• 2007

Cellobiohyolase (CBH) I 유전자의 확보는 CBH I 유전자 cellulase 생산 균주인 Trichoderma reesei를 배양, 수거하고 액체 질소를 이용하여 세포를 파쇄 후 RT-PCR kit를 이용하여 CBH I gene을 합성하였다. 그 후 발현벡터인 pYGAL에 cloning하였다. CBH I 유전자 앞부분에는 CBH I 단백질이 cell 외부로 분비할 수 있도록 하는 ppL이 포함되었다. CBH I 단백질 발현은 Protein gel 결과를 통하여 발현을 확인하였다. Cellulase 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발은 error prone PCR과 DNA shuffling을 수행하였다. 얻은 CBH I 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 효모에 transformation하여 이것을 다시 screening하였다. 1차 screening 후 confirm test하기 위해 DNS (Dinitrosalicylic Acid) 환원당 측정법을 이용하였으며, 이 결과 121-D8, 228-G2, 389-E3, 412-B4, 456-D2의 cellulase 변이체를 획득할 수 있으며, 456-D2의 경우 original CBH I과 비교하여 약 510%의 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 분자 진화 된 cellulase sequence 분석결과 CBH I wild type과 비교하였을 때 121-D8의 경우 변경된 9개의 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 228-G2의 경우 변경된 7개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 4개, 389-E3의 경우 변경된 13개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 9개, 412-B4의 경우 변경된 9개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 456-D2의 경우 변경된 10개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 7개이었다. Cellulase 생산 공정 최적화는 5 L 발효기를 이용하여 고농도 배양을 실험한 결과 최종 O.D. 120까지 진행할 수 있었으며, 약 1.2 g/L의 cellulase를 얻을 수 있었다. Cellulase 생산 공정 scale-up 5 L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 300 L로 scale-up하여 실험하였다. 최종 O.D.는 약 280 정도이며 cellulase의 발현양은 약 3.2 g/L 수준임을 확인하였다. Cellulase 정제 공정 최적화 결과 80%의 수율과 95%의 순도를 확보하였다.