The Development of Expression Process Leading to Ethanol Production with Highly Active Cellulase Modified by Directed Evolution

Although Energy demands of modern society increase rapidly, current energy would be exhausted shortly. Therefore development of bio-ethanol production process from cellulose containing materials was extremly demanded. Therefore development of highly functional cellulase is requisite for this purpose. In this study cellobio-hydrolase (CBH1) gene from Trichorderma reesei was used to increase cellulase activity by directed evolution and highly functional cellobio-hydrolase was obtained and characterized.

목질계 Cellulose로부터의 Ethanol의 경제적인 생산공정을 위하여 분자진화에 의한 활성이 획기적으로 증가된 Cellulase의 대량 발현공정 개발

Cellobiohyolase (CBH) I 유전자의 확보는 CBH I 유전자 cellulase 생산 균주인 Trichoderma reesei를 배양, 수거하고 액체 질소를 이용하여 세포를 파쇄 후 RT-PCR kit를 이용하여 CBH I gene을 합성하였다. 그 후 발현벡터인 pYGAL에 cloning하였다. CBH I 유전자 앞부분에는 CBH I 단백질이 cell 외부로 분비할 수 있도록 하는 ppL이 포함되었다. CBH I 단백질 발현은 Protein gel 결과를 통하여 발현을 확인하였다. Cellulase 활성을 증대시키기 위한 분자진화 방법 개발은 error prone PCR과 DNA shuffling을 수행하였다. 얻은 CBH I 유전자를 발현 벡터에 삽입하고 효모에 transformation하여 이것을 다시 screening하였다. 1차 screening 후 confirm test하기 위해 DNS (Dinitrosalicylic Acid) 환원당 측정법을 이용하였으며, 이 결과 121-D8, 228-G2, 389-E3, 412-B4, 456-D2의 cellulase 변이체를 획득할 수 있으며, 456-D2의 경우 original CBH I과 비교하여 약 510%의 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 분자 진화 된 cellulase sequence 분석결과 CBH I wild type과 비교하였을 때 121-D8의 경우 변경된 9개의 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 228-G2의 경우 변경된 7개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 4개, 389-E3의 경우 변경된 13개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 9개, 412-B4의 경우 변경된 9개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 6개, 456-D2의 경우 변경된 10개의 바뀐 염기 중 아미노산의 변화에 영향을 준 염기는 7개이었다. Cellulase 생산 공정 최적화는 5 L 발효기를 이용하여 고농도 배양을 실험한 결과 최종 O.D. 120까지 진행할 수 있었으며, 약 1.2 g/L의 cellulase를 얻을 수 있었다. Cellulase 생산 공정 scale-up 5 L 규모에서 확립된 최적 fed-batch 발효 공정을 300 L로 scale-up하여 실험하였다. 최종 O.D.는 약 280 정도이며 cellulase의 발현양은 약 3.2 g/L 수준임을 확인하였다. Cellulase 정제 공정 최적화 결과 80%의 수율과 95%의 순도를 확보하였다.