호열균 B. stearotheymophilus으로부터 단백질 고차구조 형성을 촉진하는 내열성 PPIase를 정제하기 위해, 이 균체를 대량으로 배양 집균, 파쇄하여 효소활성을 측정하였다. 효소의 활성측정은 N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pAN)를 기질로 사용하였다. chymotrypsin은 기질 이성체(cis-trans 형)의 한쪽(trans)만을 특이적으로 분해하는 반응을 이용하여 PPIase 활성을 측정하였다. 호열균 추출시료로 부터 효소활성을 확인한 후, DEAE-sepharose CL-6B, Sephadex G-75로 정제 후, 최종적으로 Superose TM-12 (FPLC) gel-필트레이션으로 분자량 18kDa의 본 효소를 정제하였다. 정제한 효소의 화학적 특징을 조사한 결과 pH 7.5~8.0사이에 안정하였으며, 최적 pH는 8.0으로 나타났다. 그리고 $65^{\circ}C$에 30분간 열처리 후, 효소활성을 측정한 결과 50%이상의 잔존 활성을 갖는 내열성 효소임을 확인하였다. 정제 단백질의 N-말단 아미노산 분석은 Edman 분해법으로 39 아미노산 잔기를 결정하였다. 그리고 PPIase의 재구성(refolding) 반응은, 요소로 변성시킨 기질 RNase 1을 이용하여 이 단백질의 재구성 (refolding) 실험을 조사한 결과, PPIase는 변성 기질 RNase 1의 재구성(refolding)을 촉진하는데 높은 효과를 가지고 있었다. 호열균 유전자 라이브러리로부터 PPIase 유전자 약 3kb을 클로닝하였다. 재조합 플라스미드 cPI-40에서 프라이머(A-1, B-2)를 이용하여 PPIase N-말단을 코드하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여, 염기배열을 결정한 결과 증폭된 단편은 165염기로 형성된 55 아미노산 잔기를 코드하는 open reading frame(ORF)가 연속되고 있었다. 그리고 Edman법으로 결정한 PPIase의 39아미노산 잔기가 이 배열내에 완전히 보존되어 있었다. 이 결과로부터 이 ORF는PPIase구조 유전자의 1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다.
dsRNA결합인자인 RBF단백질을 정제하여 이의 단일 또는 이중선의 RNA 또는 DNA 와의 결합도를 측정하였다ㅓ. RBF단백질은 이들과 각각 반응시켜 그 결합도는 SDS-PAGE에 의하여 비교관찰하였다. RBF단백질은 dsRNA와은 강한 결합력을 나타낸 반면 기타의 핵산구조에 대해서는 이러한 결과를 나타내지 못하였다. 인산화 실험의 결과, RBF단백질은 poly(I) : poly(C)의 존재하에서 사람 도는 쥐 모두로 부터의 PKR 효소의 자가인산화를 유사한 방식으로 억제하였다. 이는 다른 종류의 진핵세포생물에서 단백질합성조절을 위한 PKR과 RBF가 유사한 경쟁적 관련성을 유지하면서 존재함을 시사하고 있다.
중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하려면 세포 용해(cell lysis)와 DNA추출(DNA purification)과정이 포함된 시료 전처리 과정을 거쳐야 한다. 종래의 시료 전처리 과정은 계면활성제와 같은 세포용해 버퍼를 이용하거나 열 또는 전기적 방법으로 세포막 파열을 유도하여 세포벽을 깬 후에 잔여물 처리과정을 거쳐 DNA를 추출하게 된다. 본 연구에서는 마이크로 비드와 PDMS 기둥을 이용한 필터가 있는 시료 전처리용 바이오칩을 설계 및 제작하였다. 또한 제작된 바이오칩을 사용하여 $80^{\circ}C$에서 2분간 세포용해를 수행하고 DNA를 추출하였다. 칩에서 전처리과정을 거친 시료내의 DNA농도와 순도를 측정하고 DNA PCR과 겔 전기영동을 통해 시료 전처리용 바이오칩의 성능을 평가하였다.
콩 단백질은 글리시닌과 $\beta$-콘글리시닌을 주요 성분으로 한다. 영양성 및 가공 특성을 개선하기 위하여 유전자공학적인 방법을 시도하였다. 즉 $\beta$-콘글리시닌의 $\beta$-서브유니트를 유전자 클로닝하고 대장균에서 발현시켰다. 발현벡타는 pET 21d이며 플라스미드를 구축하여 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 발현된 단백질은 균체 전체 단백질의 20%이며 가용화 상태로 축적되었다. 축적 발현단백질은 천연의 $\beta$-콘글리시닌과 동일항 트리머로 확인되었다. 정제는 황산암모늄 20~40% 분별침전, Q-Sepharose 이온교환크로마토그라피, Butyltoyopearl 소수성 컬럼크로마토그라피로 하였다. 이것은 콩 단백질의 특성을 규명하는데 필요한 대장균 대량 발현계를 확립하고 발현 단백질의 정제방법을 확립한 결과이다.
Eicosapentaenoic acid 생산 세균을 얻기 위해 1999~2000년 하계연구 기간 중에 남극 생물 및 침적토를 사용하여 600주의 균주를 분리하였고 TLC와 GC를 사용하여 오메가-3 고도불포화 지방산 EPA를 생산하는 미생물 7 주를 성공적으로 분리하였으며, 이중 EPA 생산이 가장 높은 L93 균주를 선발하였다. 16S rDNA의 염기서열 분석을 통하여 Shewanella 속으로 조사되었으며, 이에 분리된 균주를 Shewanella sp. L93라 명명하였다. EPA를 생산 최적 배양온도 $4^{\circ}C$이며, 초기 pH 7에서 최적 EPA 함량을 보였다. 아울러 염 농도는 50 %(w/v)에서 생산이 최대였다. EPA 최적 생산 조건을 이용하여 리터당 320 mg 생산할 수 있는 생산 시스템을 확립하였다. Urea 침전법과 HPLC을 이용하여 수율 72% 이상의 97% 순도를 가진 EPA를 정제할 수 있는 분리 정제 시스템 또한 본 연구를 통하여 확립하였다.
Bacillus circulans로부터 mitomycin C처리에 의해 유발되는 Bacteriophage Sigma FA1을 서당밀도균배 원심법 (sucrose gradient centrifugation)에 의해 분리, 정제하였다. Sigma FA1의 감수성숙주에 대한 치사작용은 single-hit 방식이었다. 한편, 세포에 감여된 후 phage DNA는 천천히 분해되기 시작했으며, 본 연구의 결과는 Sigma FA1의 세포에 대한 치사작용이 기존의 것과는 다른 것임을 입증시켰으며, 이는 단 백질분해기능에서 유래되는 듯 했다.
유전자 발현은 많은 전자조절인자에 의해서 조절된다. 이러한 조절인자들은 각각 DNA 상에 존재하는 특정한 모티프에 결합하여 그 기능을 수행한다. 따라서 DNA 상의 특정한 서열 정보가 유전자 발현과 직접적으로 연관되어 있다고 생각할 수 있다. 본 논문에서는 두 가지 서로 다른 데이터들에 대한 관계를 알아보기 위하여 사용되는 방법인 Kernel CCA를 이용하여 DNA 상의 특정한 모티프와 유전자 발현 사이의 관계를 알아보았다. 이를 이용한 실험 결과, 유전자 발현과 밀접하게 관련되어 있는 모티프들을 발견할 수 있었고, 기존에 중요한 것으로 알려져 있는 모티프가 실제로도 유전자 발현에 밀접한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
Aflatoxin은 세계 여러 곳에서 식품에 오염되어 발견되며 증가하는 인간의 간암발생과 빈번히 역학적으로 관련하여 보고되는 발암물질이다. 이러한 aflatoxin의 발암성 규명에 대한 연구의 일환으로 20 mg calf thynmus DNA와 8 mg 표준 aflatoxin $B_1$을 반응시켜 화학적으로 aflatoxin $B_1$을 반응시켜 화학적으로 aflatoxin $B_1-DNA$ adduct를 합성하였다. 합성된 aflatoxin $B_1-DNA$ adduct는 산가수분해와 열처리에 의해 거대한 DNA 분자를 절단하였고, immunoaffinity column을 통과시켜 aflatoxin $B_1-DNA$ adduct만 선택적으로 정제한 후 HPLC법으로 정량하였다. 그 결과 반응생성물의 대부분은 aflatoxin $B_1-guanine$ adduct였으며, 그 함량은 aflatoxin $B_1$으로 5.2 mg이었다.
미꾸라지의 성장호르몬 유전자를 분리하기 위하여 미꾸라지의 cDNA library를 준비하였다. total RNA는 미꾸라지의 뇌하수체로부터 얻었으며 oligo (dT)-coupled magnetic bead를 이용하여 total RNA로부터 mRNA를 순수분리하였다. 정제된 mRNA는 cDNA를 합성하기 위한 기질로 사용하였으며, 합성된 cDNA는 EcoRV/Smal으로 절단된 pBlueKS+ plasmid vector에 삽입하였다. 모든 ligation 반응용액을 E. coli, JM109 균주에 형질전환을 유도하였으며 형질전환 효율을 최대화시키기 위하여 전기천공법을 이용하였다. 얻어진 모든 형질전환주들을 DIG로 표지된 Tilapia의 성장호르몬 유전자를 이용하여 고밀도 colony hybridization 에 의하여 검색하였다. 양성반응을 나타내는 10개의 형질전환주를 분리하여 2차 colony hybridization 및 southern hybridization에 의하여 성장호르몬 유전자가 cloning 되었음을 확인하였다. 10 개의 형질전환주 중 하나인 pCGH1을 probe로 사용한 Tilapia 성장 호르몬 유전자의 염기서열과 비교분석하였으며 53.2%의 유사성을 나타냄을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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