• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제16권1호
• /
• pp.20-24
• /
• 2006

Plasmid DNA (pDNA) is a product of interest for many biopharmaceutical companies and research laboratories, because of increase in the number of gene therapy protocols that use nonviral vectors. This work was undertaken to study the effect of antibiotic and dissolved oxygen concentration (DOC) on the production of a ColE 1-type plasmid (pVAX1-LacZ) hosted in Escherichia coli $DH5\alpha$ and cultured in a batch fermentor with 0.751 of Terrific Broth. A decrease in the DOC from $60\%\;to\;5\%$ was shown to increase the specific pDNA concentration approximately 1.5-fold, due to the downregulation of growth. Additionally, this increase in the pDNA concentration led to a 2.2-fold increase in the purity of cell lysates obtained after cell lysis. However, the use of higher DOC led to 2.8-fold higher volumetric productivity as a consequence of a faster growth rate, reducing the fermentation time from 24 to 8 h. Interestingly, the specific pDNA concentration, and pDNA productivity and purity were always higher $(10-15\%)$ in the absence of antibiotic. Overall, the data indicate that nonselective conditions can be used without compromising yield, productivity, and purity of pDNA.

• 미생물학회지
• /
• 제30권2호
• /
• pp.134-140
• /
• 1992

Teh $polA^{+}$ gene can be transducted in a multicopy mini-Mu plasmid, but not cloned because the product of this gene is lethal when overproduced. Although, we obtained one surviving cell, in which the ColEl-derived mini-Mu plasmid suffered a spontaneous deletion exactly at the region where the $polA^{+}$ gene was cloned. The $PolA^{+}$ unstream flanking sequence containing the promoter and pribnow-box was delected in vivo ; consequently this gene is not able to be expressed.

• BMB Reports
• /
• 제30권2호
• /
• pp.162-165
• /
• 1997

RNA I. a negative controller of ColE1-type plasmid replication, is metabolized by several RNases in Escherichia coli. Two small derivatives of RNA I are accumulated at nonpermissive temperatures in an E. coli strain carrying the rnpA49 mutation, a thermosensitive mutation in the rnpA gene encoding the protein component of RNase P. A primer extension analysis was carried out to compare 5' processing of RNA I in the E. coli rnpA49 cells at both permissive and nonpermissive temperatures. Derivatives of RNA I having different 5' ends were observed in the cells grown at permissive and nonpermissive temperatures. Some of the derivatives may be generated by the cleavage of RNase P.

• 미생물학회지
• /
• 제44권2호
• /
• pp.93-97
• /
• 2008

최근 Escherichia coli에서 RNA의 분해와 가공과정에 중추적인 역할을 하는 리보핵산 내부분해효소인 RNase E의 효소활성을 조절하는 단백질 조절자인 RraA가 밝혀졌으며, 이 단백질은 E. coli RNase E의 효소활성 부위와 36%의 유사성을 가지는, Streptomyces coelicolor RNase ES의 효소활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. S. coelicolor의 유전체에는 RraA와 아미노산 서열이 35.4% 이상 유사한 단백질을 코딩하는 유전자가 두 개 존재하는데, 그 중 하나인 rraAS2를 클로닝하여 E. coli RNase E의 효소활성을 조절하는지를 알아보았다. 그 결과 세포내에서 RraAS2를 발현시키면 RNase E의 과발현에 의해 저해된 세포의 생장을 RraA와 같이 효과적으로는 아니지만, 어느 정도 복원시키는 것을 확인하였다. 또한 RraAS2가 발현됨으로서 RNase E의 과발현에 의해 증가된 ColE1-타입 플라스미드의 복제 수를 14% 감소시키는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 RraAS2가 RNase E의 RNA I분자에 대한 효소 활성을 저해하는 능력을 가지고 있음을 시사한다. 동일한 배양조건에서 E. coli 세포내에서의 RNase E에 대한 RraAS2의 상대적인 발현양이 RraA에 비해 6.2배 낮은 것을 확인하였고, 이로 인해 RraAS2가 RNase E의 과발현에 의한 세포 생장의 저해를 복원하는데 필요한 모든 RNA의 가공과 분해속도를 효과적으로 조절하지는 못한다는 것을 추론할 수 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제16권1호
• /
• pp.118-125
• /
• 2006

The region responsible for replication of the megaplasmid pAtC58 in the nopaline-type Agrobacterium tumefaciens strain C58 was determined. A derivative ofa Co1E1 vector, pBluscript SK-, incapable of autonomous replication in Agrobacterium spp, was cloned with a 7.6-kb Bg1II-HindIII fragment from a cosmid clone of pAtC58, which contains a region adjacent to the operon for the utilization of deoxyfructosyl glutamine (DFG). The resulting plasmid conferred resistance to carbenicillin on the A. tumefaciens strain UIA5 that is a plasmidfree derivative of C58. The plasmid was stably maintained in the strain even after consecutive cultures for generations. Analysis of nested deletions of the 7.6-kb fragment showed that a 4.3-kb BglII-XhoI region sufficiently confers replication of the derivative of the ColE1 vector on UIA5. The region comprises three ORFs, which have high homologies with repA, repB, and repC of plasm ids in virulent Agrobacterium spp. including pTiC58, pTiB6S3, pTi-SAKURA, and pRiA4b as well as those of symbiotic plasmids from Rhizobium spp. Phylogenie analysis showed that rep genes in pAtC58 are more closely related to those in pRiA4 than to pTi plasmids including pTiC58, suggesting that the two inborn plasmids, pTiC58 and pAtC58, harbored in C58 evolved from distinct origins.

• 미생물학회지
• /
• 제43권4호
• /
• pp.325-330
• /
• 2007

대장균의 필수적인 리보핵산 내부분해효소인 RNase E는세포내에서 여러 RNA의 분해와 가공과정에서 중요한 역할을 하며, 이 단백질의 효소활성부위를 포함하는 N-말단부위의 498 아미노산(N-Rne)만의 발현으로도 세포의 생장을 가능하게 한다. 이러한 RNase E의 특성을 활용하여 다양한 표현형을 가지는 N-Rne 돌연변이체들을 분리, 동정할 수 있는 효율적인 유전학적 시스템을 개발하였다. 이 시스템을 이용하여 얻어진 효소활성부위 돌연변이체들을 표현형으로 분류하여 분석한 결과, S1 도메인의 6번째 아미노산의 치환(I6T)을 가진 변이체는 야생형 N-Rne의 기능을 대체하지 못하였고, Small 도메인의 488번째 아미노산의 치환(R488C)을 가진 변이체는 야생형 N-Rne의 발현양보다 현저히 작게 발현시켜도 세포의 생장을 정상적으로 가능하게 하였다. 또한 DNase I 도메 인의 305번째 아미노산의 치환(N305D)을 가진 변이체는 야생형 N-Rne의 발현양보다 과발현시켰을 때만 세포의 생장을 가능하게 하였다. 각각의 아미노산 치환을 포함하는 N-Rne를 한정적으로 과발현시켰을 때의 ColEl-타입 플라스미드의 복제 수에 대한 영향을 측정한 결과, 돌연변이체 N-Rne의 세포생장에 대한 영향은 이 변이체들의 세포 내 효소활성 정도에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 실험결과는 이 연구에서 개발한 유전학적 시스템을 이용하여 다양한 표현형을 가진 RNase E 변이체를 선별할 수 있으며, 이 변이체들의 특성을 분석함으로써 RNase E가 RNA의 안정성을 조절하는데 있어서 각각의 세부 도메인의 역할을 규명할 수 있으리라는 것을 시사한다.

• 미생물학회지
• /
• 제46권2호
• /
• pp.223-227
• /
• 2010

RNase E는 대장균 내에 있는 수많은 RNA의 분해와 가공에 관여하며, 또한 RNA 대사 작용에 관련된 거대한 단백질 복합체인 데그라도좀을 구성하는 중요한 효소로 알려져 있다. RraA와 RraB는 최근에 밝혀진 RNase E의 단백질 저해제이며, 진화적으로 잘 보존되어 있다. 이 연구에서는 RraA를 발현 시킬 때와는 달리 세포 내에서 RraB를 발현 시키면, RNase E의 과발현에 따른 세포의 성장 저해를 회복시키지 못하고 더 저해하는 것을 확인하였다. 이 현상이 RraA와 RraB가 세포내 RNase E의 기질들에 대해 특이적으로 영향을 미치기 때문인지를 알아보기 위해 세 개의 RNase E 기질을 분석하였다. 그 결과, ColE1-타입 플라스미드의 복제수를 조절하는 RNA I과 라이보좀 단백질 S15를 코딩하는 rpsO mRNA의 경우 RraA가 RraB 보다 효과적으로 RNase E의 활성을 저해하며, RNase P의 RNA 구성요소의 전구체인 pM1 RNA에 대한 RNase E의 효소 활성은 RraB가 저해하지 못하는 것을 관찰하였다. 이 결과는 RraB가 RraA보다는 높은 기질 특이적으로 RNase E의 효소활성을 저해하며, 이러한 이유로 RNase E의 과발현에 의한 세포의 성장 저해를 RraB의 과발현으로 극복할 수 없었다고 추론할 수 있다.