식물성장 촉진호르몬인 auxin, 식물병원성 진균을 방제하는 siderophore 그리고 cellulase를 동시에 생산하는 PGPR균이자 생물방제균인 Bacillus licheniformis K11의 cellulase의 유전자를 PCR을 이용해 pUC18에 재조합 후 E. coli DH5${\alpha}$에 cloning하였으며, 이 형질전환 된 균주를 E. coli DH5${\alpha}$(pCW 77)라 하였다. 형질전환 균주 E. coli DH5${\alpha}$(pCW 77)는 B. licheniformis K11의 1.6kb 유전자를 포함하며, 이 cellulase는 1,479 bp, 499개의 amino acid가 암호화된 것으로 추정된다. 형질전환균주가 생산하는 cellulase(CelW)는 lac 프로모터를 이용해 발현되었으며, CMC-SDS-PAGE의 방법으로 약 55 kDa의 분자량을 확인하였다. B. licheniformis K11의 cellulase는 4종의 대표적인 Bacillus spp. 들이 생산하는 cellulase의 아미노산 배열이 97% 이상 일치하였다. CelW는 carboxymethyl-cellulose(CMC) 뿐만 아니라 불용성 섬유소인 Avicel, Filter paper(Whatman$^{\circledR}$ No. 1)는 물론이고 고추역병균 P. capsici의 건조 cell wall도 분해하였다. CMC를 기질로 60$^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 높았으며, 최적 pH는 pH 6.0이었다. 그리고 CoCl$_2$ 또는 MnSO$_4$ 첨가시 활성이 2배 이상 증가하였지만, FeCl$_3$ 또는 HgCl$_2$ 첨가 시는 활성이 20% 이하로 떨어졌고, SDS와 sodium azide 등 여러 화학 저해제들을 첨가하여도 87% 이상의 활성을 유지하였다. 이 결과들은 B. licheniformis K11이 식물뿌리에 근권 microflora형성의 중요한 요인으로 작용할 수 있고, 생물방제력을 발휘하는 식물병원성 진균의 세포벽 분해 cellulase 기능 연구를 가능케 하여 식물병의 생물학적 방제 연구에 기초가 될 것이라 생각된다.
Soft-rot bacterial pathogen, Erwinia sp., was isolated from chinese cabbage tissue showing soft-rot symptom. This bacterial strain caused soft-rot to chinese cabbage and potato, and it was identified as Erwinia carotovora subsp. carotovora LY34 (E. c. subsp. carotovora LY34). Erwinia carotovora subsp. carotovora LY34 did not have hemicellulase but extracellular cellulase, pectinase, polygalacturonase, protease activity. The results of the microscopy showed that chinese cabbage tissue and potato tissue were macerated by infection of E. c. subsp. carotovora LY34. In analysis of the cellulases activity of the isolated cellulose-degradation enzymes from E. c. subsp. carotovora LY34 total protein, three cellulase activity bands were detected by non-denaturation gel electrophoresis method and five cellulase activity bands were detected by CMC-SDS-PAGE direct stain method.
한우의 반추위에서 게놈 DNA를 분리하여 메타게놈 은행을 구축한 다음 섬유소분해효소를 암호화하는 유전자를 클로닝 및 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하고 유전산물의 생화학적인 특성을 조사하였다. $cel$5C 유전자는 1,125 bp로 374개의 아미노산 잔기를 가진 단백질을 암호화하였으며 이 단백질 분자량은 42 kDa이었다. 이 효소의 최적 pH는 4 근방이었으며 최적 온도는 $50^{\circ}C$ 부근이었다. $cel$5C 유전자의 internal primer를 사용하여 인공적으로 배양할 수 있는 49종의 반추세균에서 분리한 게놈 DNA을 주형으로 PCR 분석한 결과 해당하는 밴드를 확인할 수 없었다. Cel5C는 현재로서는 배양할 수 없는 반추 미생물로 추정된다.
Pseudomonas sp. JH1014는 세제 첨가용으로 사용 가능한 알칼리성 단백질 분해효소를 생산하는 균주로 하천수에서 분리되었다. 이 균주는 LB 배지에서는 CMCase를 생산하지 않았으나, 배지에 기질인 carboxymethyl cellulose를 첨가하면 분해효소인 CMCase의 생산이 유도되었으며, CMC 첨가에 따른 증식 양상의 변화는 없었다. CMC를 첨가한 배지로 $37^{\circ}C$에서 진탕배양 하였을 때 균의 증식은 $9{\sim}12$시간 후에 최대에 도달하였으며, 생산된 효소의 활성은 21시간 후에 최대에 도달하였다. 조효소액의 CMCase 활성 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 $55^{\circ}C$였으며, $70^{\circ}C$에서 10분 동안 열처리한 후의 잔존활성은 70%였다. 부분 정제된 효소를 SDS-PAGE 후 활성염색한 결과 분자량이 54와 30 kDa인 두 개의 활성띠가 관찰되어, Pseudomonas sp. JH1014는 적어도 두 종류의 CMCase를 생산하는 것으로 보인다.
본 연구는 능이(Sarcodon aspratus)로부터 protease를 분리, 정제하고 이의 효소적 특성을 구명하고자 실시하였다. 정제가 진행되어감에 따라 protease의 비활성은 점차 증가하였는데, 탈염에 의해 비활성이 2.62배 증가하였으며, CMC column 처리로 17배, DEAE-Sephadex A-50 column 처리로 113.8배, Sephadex G-75 column 처리로 728.3배로 증가됨을 알 수 있었다. SDS-PAGE 전기영동 결과, single band의 분자량 약 43,000의 단백질임을 알 수 있었다. 최적 pH 3.5 부근의 정제 protease은 pH 4.35 및 pH 4.7의 등전점을 달리하는 protease가 확인되었으며, 이들 fraction의 비활성은 각각 3,025배 및 3,257배였다. 이들 효소들은 등전점만 다를 뿐, 효소적 특성이 거의 동일하였다. 이 protease는 pH 4에서 최적의 활성을 보였으며, pH 4~7의 범위에서 안정한 활성을 나타냈다. 이 protease의 최적 온도는 40~50℃ 범위였으며, 온도안정성을 조사한 결과, 60℃ 이상의 온도에서 급격한 활성저하를 나타내었다. 50℃에서는 80% 정도의 활성이 유지되었으며, 60℃로 온도가 올라가면 45%, 70℃에서는 거의 활성이 나타나지 않을 정도로 미미하였고, 80℃ 이상에서는 활성이 완전히 잃어버리게 됨을 알 수 있었다. 열에 대한 안정성에 있어서는 30℃ 및 40℃에서 1 h 열처리에서는 매우 안정한 활성을 보였으며, 50℃에서도 70 min간 처리로 90%의 안정성을, 60℃ 및 70℃에서는 10~20 min 처리로 급격한 효소의 활성저하가 시작되었으며, 70℃에서 30 min 처리로 효소의 활성이 없어짐을 알 수 있었다.
To improve the expression efficiency of recombinant endo-$\beta$-1,4-glucanase in P. pastoris, the endo-$\beta$-1,4-glucanase (egI) gene from Aspergillus niger was synthesized using optimized codons. Fourteen pairs of oligonucleotides with 15 bp overlap were designed and the full-length syn-egI gene was generated by two-step PCR-based DNA synthesis. In the synthesized endo-$\beta$-1,4-glucanase gene syn-egI, 193 nucleotides were changed, and the G+C content was decreased from 54% to 44.2%. The syn-egI gene was inserted into pPIC9K and transformed into P. pastoris GS115 by electroporation. The enzyme activity of recombinant P. pastoris stain 2-7# reached 20.3 U/ml with 1% barley $\beta$-glucan and 3.3 U/ml with 1% carboxymethylcellulose (CMC) as substrates in shake flasks versus 1,270.3 U/ml and 220.7 U/ml for the same substrates in 50-1 fermentors. The molecular mass of the recombinant protein was approximately 40 kDa as determined by SDS-PAGE analysis, the optimal temperature for recombinant enzyme activity was $70^{\circ}C$, and the optimal pH was 5.0 when CMC was used as the substrate.
A cellulolytic strain Y2 was isolated from soil obtained in the Canadian Alpine region. The isolate was identified as Paenibacillus sp. Y2 by 16S rRNA sequencing. When grown in LB medium supplemented with carboxymethyl-cellulose (CMC), CMCase production increased to 122.0% of that observed in LB without CMC. Culture supernatant was concentrated by ultrafiltration and 80% ammonium sulfate precipitates were separated by Hi-Trap Q and CHT-II chromatography. The purified enzyme (EG-PY2) showed a homogeneous single band and the molecular mass was estimated to be 38 kDa by SDS-PAGE. Optimum pH and temperature of the enzyme were 4.5 and $30^{\circ}C$, respectively. The half-life of enzyme activity at 50 was 140.7 min, but the enzyme was drastically inactivated within 5 min at $55^{\circ}C$. The enzyme was highly activated to 135.7 and 126.7% by 5.0 mM of $Cu^{2+}$ or $Mg^{2+}$ ions, respectively, and moderately activated by $Ba^{2+}$ and $Ca^{2+}$ ions, whereas it was inhibited to 76.8% by $Fe^{2+}$, and to ${\leq}50%$ by $Mn^{2+}$, $Co^{2+}$, $Zn^{2+}$, and EDTA. The enzyme was activated to 211.5% in the presence of 0.5 M of NaCl and greatly tolerant to 3.15M of NaCl. The enzyme showed 2.98 times higher ${\beta}$-glucanase activity than CMCase activity. Based on these results, it can be concluded that EG-PY2 is an acidophilic, cold-active, and halotolerant endoglucanase. The authors suggest it is considered to be useful for various industrial applications, such as, fruit juice clarification, acidic deinking processes, high-salt food processing, textile and pulp industries, and for biofuel production from seaweeds.
Trichoderma sp. C-4의 배양액으로부터 한 종류의 endoglucanase(F-II-II)를 Sephacryl S-200 및 Sephacryl S-100 chromatography를 통하여 분리하였다. 분리된 효소는 SDS-PAGE및 isoelectric focusing을 통하여 단일 band로 나타났으며, 분자량이 26,000, 등전점이 8.0으로 나타났다. 이 효소의 반응 최적온도와 최적 pH는 각각 $50^{\circ}C$, 5.0 이었으며, $50^{\circ}C$에서 24시간 동안 안정하였다. 분리된 효소의 carboxymethylcellulose에 대한 specific activity는 776.2 U/mg protein으로 나타났다. 이 효소의 아미노산 조성을 조사하였다. 효소를 trypsin으로 가수분해한 후 분해산물에 대한 단백질서열 분석을 행하였다. 그 결과 이 효소의 서열은 현재까지 밝혀진 다른 단백질과 homology를 갖지 않음이 확인되었다. 이 효소는 그 specific activity가 대단히 높고 아직 보고되지 않은 novel protein일 가능성이 대단히 높기 때문에 좋은 유전자 자원이 될 것으로 사료되었다.
Three types of xylanases (EC 3.2.1.8) were detected in the strain Aspergillus niger A-25, one of which, designated as XynIII, also displayed ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ (EC 3.2.1.73) activity, as determined by a zymogram analysis. XynIII was purified by ultrafiltration and ion-exchange chromatography methods. Its apparent molecular weight was about 27.9 kDa, as estimated by SDS-PAGE. The purified XynIII could hydrolyze birchwood xylan, oat spelt xylan, lichenin, and barley ${\beta}-glucan$, but not CMC, avicel cellulose, or soluble starch under the assay conditions in this study. The xylanase and ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ activities of XynIII both had a similar optimal pH and pH stability, as well as a similar optimal temperature and temperature stability. Moreover, the effects of metal ions on the two enzymatic activities were also similar. The overall hydrolytic rates of XynIII in different mixtures of xylan and lichenin coincided with those calculated using the Michaelis-Menten model when assuming the two substrates were competing for the same active site in the enzyme. Accordingly, the results indicated that XynIII is a novel bifunctional enzyme and its xylanase and ${\beta}-(l,3-1,4)-glucanase$ activities are catalyzed by the same active center.
Lee Sang-Cheol;Yoo Ju-Soon;Kim Sun-Hee;Chung Soo-Yeol;Hwang Cher-Won;Joo Woo-Hong;Choi Yong-Lark
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제16권5호
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pp.716-723
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2006
A biosurfactant-producing bacterial strain was selected from oil-contaminated soil because of its ability to degrade crude oil and tributyrin $(C_{4:0})$. The strain was identified as Bacillus subtilis A8-8 based on its morphological, biochemical, and physiological characteristics. When B. subtilis A8-8 was grown with crude oil as the sole carbon source, the biosurfactant from the strain emulsified crude oil, vegetable oil, and hydrocarbons. Soybean oil was the optimum substrate for the emulsifying activity and emulsion stability of the biosurfactant, both of which were superior to those of several commercially available surfactants. The biosurfactant was purified by a procedure including HCl precipitation, methanol treatment, and silica-gel chromatography. The partially purified biosurfactant was analyzed by TLC (thin-layer chromatography), SDS-PAGE, and HPLC and it reduced the surface tension of water from 72 mN/m to 26 mN/m at a concentration of 30 mg/l. Therefore, the purified lipopeptide biosurfactant has strong properties as an emulsifying agent and acts as an emulsion-stabilizing agent.
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