Bacterial lysates have become a common ingredient for natural health care. Lactic acid bacteria (LAB) could serve as potential candidates for lysate production: the lactic acids produced by LAB have been utilized for their moisturizing, antimicrobial, and rejuvenating effects, while other substances provide topical benefits and health effects for the skin. Our study aimed to obtain lysate from a LAB S. macedonicus MBF 10-2 through an optimized fermentation using the Response Surface Methodology. Strain MBF10-2 was cultivated in a 2L fermenter tank in de Man Rogosa and Sharpe (MRS) medium and in plant-based peptone modified MRS, i.e. Soy-peptone and Vegitone. The duration and the medium composition (dextrose and soy peptone or proteose peptone) were adjusted to obtain an optimum production of cell lysate. Central Composite Design was employed for Design Expert 7.0.0 by adjusting 3 factors: dextrose (1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%), soy or proteose peptone (0.5%, 0.75%, 1%, 1.25% and 1.5%), and duration of fermentation (8, 10, 12 14, and 16 h for MRS-Soy peptone and 15, 17, 19, 21, and 23 h for MRS Vegitone). Bacteriocin-Like Inhibitor Substance activity of lysate and pH were used as indicators. The optimum condition for lysate production using MRS Soy Peptone and Vegitone are as follows: dextrose concentration 2.5%, plant-based peptone 1.25%, while optimum fermentation duration were 11.18 h (MRS Soy Peptone) and 17 h (MRS Vegitone) with a starter concentration of 10% at $OD_{600nm}$$0.2{\pm}0.05$. However, the standard MRS medium produced better quality lysate compared to MRS plant-based peptones.
피부에는 여러 종의 미생물들이 군집을 이루며 서식하고 있고, 서로 상호작용을 하며 균형을 유지하고 있다. 하지만, 여드름, 건선 및 아토피 피부염과 같은 질병 상태에서는 피부 미생물의 균형이 깨져 건강한 피부와는 다른 미생물 군집 구성을 보인다. 피부 미생물 군집 구성의 조절은 이러한 피부 질환에 대한 잠재적인 치료 방법이 될 수 있다. Quorum sensing (QS)은 세포간 전달인자로, QS을 조절하면 유해균의 바이오필름 형성이나 효소 분비등을 억제할 수 있고, 이 역시 피부 미생물 군집 구성에 영향을 준다. 이번 연구에서는 아모레퍼시픽의 특허 성분인 유산균 발효 용해물(Lactobacillus plantarum APsulloc 331261, KCCM 11179P 이용)의 QS억제능력 및 피부 유익균과 피부 유해균의 생장에 미치는 영향을 확인하였다. 유산균 발효 용해물 10 ㎍/mL 처리시, QS에 의해 제어되는 Chromobacterium violaceum의 자주색 안료 생산을 대조군 대비 27.4% 감소시켰다. 또 피부 유익균인 Staphylococcus epidermidis의 생장을 대조군 대비 12% 증가 시켰고, 피부 유해균인 Pseudomonas aeruginosa의 생장을 38.5% 감소, 바이오필름 형성을 17.7% 감소시켰다. S. epidermidis를 같은 속(genus)에 포함되어 있는 대표적인 피부 유해균 Staphylococcus aureus와 함께 공배양 하였을 때 S. epidermidis의 생장은 대조군 대비 134% 증가시켰고, S. aureus의 생장은 13% 억제시켰다. 이러한 결과들을 종합하였을 때 L. plantarum APsulloc 331261을 이용한 발효 용해물은 피부 미생물의 균형을 조절해 줄 수 있는 화장품 원료로 유용하게 사용 될 수 있다고 사료된다.
The objects of the present study were to establish the method of purification, subunit dissociation of verotoxin-2 (VT2) produced by Escherichia coli O157:H7, and to investigate the characteristics of purified verotoxin-2 such as molecular weight and composition of amino acid. The results were summerized as follows; Verotoxin-2 was extracted by addition of polymyxin B sulfate into bacterial cell lysate prepared from Escherichia coli O157:H7(KSC109). As an initial step, the bacterial cell lysate was precipitated with 30% saturated ammonium sulfate. The precipitated crude toxin was then subjected to anion-exchange, chromatofocusing and cation-exchange chromatography. Using this scheme, we obtained highly purified toxin with a specific activity of $1.1{\times}10^9$$CD_{50}/mg$. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) for purified VT2 showed two protein bands. The upper band, approximately 32 Kd, was supposed as A subunit and the lower band, approximately 7.7 Kd, was supposed as B subunit. When the toxin was separated in the subunit-dissociating solution, two peaks emerged with retention times of 15 and 28 min by HPLC. These peaks represented A subunit and B subunit, respectively. The amino acid composition of purified VT2 were made up in order of glutamic acid, histamine, asparaginic acid, histidine, lysine, alanine and leucine etc. The largest amount among the amino acid composing VT2 was methionine.
한국환경보건학회 2003년도 Challenges and Achievements in Environmental Health
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pp.132-135
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2003
Endotoxin concentrations were measured from 69 point-of-use(POU) water treatment system(WTS) by using Limulus amebocyte lysate(LAL) assay, and the results were compared to heterotrophic bacterial data. Endotoxin concentrations in all POU WTS water samples and tap waters varied within the range 0.8-79.1EU mL$\^$-1/ and 0.1-3.4EU mL$\^$-1/, respectively, The correlations between endotoxin concentration and HPC bacteria from the water samples showed not significant(r=0.18).
ClpP is a stress-inducible protein and proteolytic subunit of the ATP-dependent Clp protease in prokaryotes and eukaryotes. Although its physiological roles in bacterial virulence were widely studied in various organsims, including Streptococcus pneumoniae, until now the immunological effect has not been investigated. Here, we have examined the cross reactivity of S. pneumoniae ClpP antibody with other organisms's cell lysate proteins. Although the protein sequence of S. pneumoniae ClpP was highly conserved among various organisms including human, the antibody rasised by S. pneumoniae ClpP was not cross-reacted with other organism's cell lysates, which were Saccharomyces cerevisiae , human lung A549 cell, Bacillus subtilis, Pseuomonas aeruginosa, E. coli, and Salmonella typhi. It was only reacted with S. pneumoniae and Lato-bacillus thermophilus. Thus we examined the immunoprotective effect of ClpP by immunizing mice with the purified ClpP. The mean survival time of mouse was significantly increased with the ClpP immunization. These results suggest that S. pneumoniae ClpP could be used as a vaccine candidate for prevention of S. pneumoniae infection.
Inflammatory reactions activated by lipopolysaccharide (LPS) of gram-negative bacteria can lead to severe septic shock. With the recent emergence of multidrug-resistant gram-negative bacteria and a lack of efficient ways to treat resulting infections, there is a need to develop novel anti-endotoxin agents. Antimicrobial peptides have been noticed as potential therapeutic molecules for bacterial infection and as candidates for new antibiotic drugs. We previously designed the 9-meric antimicrobial peptide Pro9-3 and it showed high antimicrobial activity against gram-negative bacteria. Here, to further examine its potency as an anti-endotoxin agent, we examined the anti-endotoxin activities of Pro9-3 and elucidated its mechanism of action. We performed a dye-leakage experiment and BODIPY-TR cadaverine and limulus amebocyte lysate assays for Pro9-3 as well as its lysine-substituted analogue and their enantiomers. The results confirmed that Pro9-3 targets the bacterial membrane and the arginine residues play key roles in its antimicrobial activity. Pro9-3 showed excellent LPS-neutralizing activity and LPS-binding properties, which were superior to those of other peptides. Saturation transfer difference-nuclear magnetic resonance experiments to explore the interaction between LPS and Pro9-3 revealed that Trp3 and Tlr7 in Pro9-3 are critical for attracting Pro9-3 to the LPS in the gram-negative bacterial membrane. Moreover, the anti-septic effect of Pro9-3 in vivo was investigated using an LPS-induced endotoxemia mouse model, demonstrating its dual activities: antibacterial activity against gram-negative bacteria and immunosuppressive effect preventing LPS-induced endotoxemia. Collectively, these results confirmed the therapeutic potential of Pro9-3 against infection of gram-negative bacteria.
세균내독소는 lipopolysaccharide (LPS)라고 불리우며, 그람음성 세균의 세포벽에 존재하는 물질로 어느 생체재료나 액체에 존재할 수 있다. 세균내독소가 혈액으로 침투되면 발열 및 염증을 유발시킨다. 본 연구에서는 장내 그람음성세균인 Escherichia coli O157:H7, Klebsiella oxytoca, Salmonella Typhi, Shigella sonnei, Morganella morganii의 LPS 양을 비교하려 하였다. 각 세균은 배양한 후 $1.5{\times}10^8CFU/mL$ 농도로 희석하여 동일한 농도로 하였으며 실험의 정당성을 위하여 LAL시약의 표시감도확인시험을 진행하였다. 10 fold dilution 후 1차 시험을 하여 각 균의 반응 end point를 확인하고 바로 윗단계 희석배수 사이에서 2 fold dilution하여 균의 최종 반응 end point를 확인하였다. 결과적으로 E. coli O157은 75~37.5 CFU/mL, K. oxytoca는 37.5~18.75 CFU/mL, M. morganii와 S. Typhi는 3.75~1.875 CFU/mL, S. sonnei는 7.5~3.75 CFU/mL에서 0.015 EU/mL 이상의 endotoxin이 검출되었다. 최종적으로 억제인자에 대한 확인시험을 진행하여 결과값을 보증하였다. 본 연구를 통하여 세균내독소에 대한 추가적인 연구가 지속되기를 기원한다.
Kim, Young-Sook;Ji, Suk;Jung, Hong-Moon;Woo, Kyung-Mi;Choi, Young-Nim
International Journal of Oral Biology
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제32권3호
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pp.103-107
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2007
We hypothesized that plaque-associated bacteria may have a role in maintenance of alveolar bone. To test it, immortalized gingival epithelial HOK-16B cells were co-cultured with live or lysed eight plaque bacterial species and the expression levels of bone morphogenetic protein (BMP)-2 and -4 were examined by real time reverse transcription-polymerase chain reaction. Un-stimulated HOK-16B cells expressed both BMP-2 and -4. Co-culture with plaque bacterial lysates had significant effects on the level of BMP-2 but not on that of BMP-4. Five species including Streptococcus sanguinis, S. gordonii, Veillonella atypica, Porphyromonas gingivalis, and Treponema denticola substantially up-regulated the level of BMP-2. In contrary to the upregulatory effect of lysate, live T. denticola suppressed the expression of BMP-2. In addition, in vitro osteoblastic differentiation assay using C2C12 cells and the conditioned medium of HOK-16B cells confirmed the production of BMPs by gingival epithelial cells and the modulation of BMP expression by the lysates of S. sanguinis and T. denticola. In conclusion, we have shown that plaque bacteria can regulate the expression of BMP-2 by gingival epithelial cells, the physiologic meaning of which needs further investigation.
The polymerase chain reaction(PCR) assay was used for rapid diagnosis from blood and organ samples experimentally infected with Listeria monocytogenes. This method used a pair of primers based on a unique region in the 16S rRNA sequence of L monocytogenes. Procedure A was based on dilution of the blood sample followed by lysis of bacterial cell and direct analysis of the lysate with PCR. In artificially infected blood samples with L monocytogenes, it was possible to detect fewer than 40 cells per ml of blood. However, L monocytogenes was detected low rates on infected organs by the direct PCR. In procedure B, enrichment cultivation was used to increase numbers of bacteria before lysis and PCR. L monocytogenes was detected from 23 samples of 24 liver and spleen, respectively, and 18 samples of 24 blood were found to be positive by PCR on a subset of 72 organ samples, whereas L monocytogenes were detected on 63 organ samples in classical culture technique. It was required to analyze including enrichment steps were 6h and 18h on the procedure A and B, respectively.
엔도톡신 시험은 투구게의 혈구세포 추출성분인 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate, LAL)가 그람음성균의 지질다당체와 반응하여 응고하는 원리를 이용한 in vitro 시험법이다. 엔도톡신이 혈액 내 노출될 경우 환자에게 심각한 부작용을 발생시킬 수 있으므로 진단용 방사성의약품은 제조 후 반드시 엔도톡신 시험을 통해 의약품 내 오염여부를 확인해야 한다. 진단용 방사성의약품은 유기용매와 완충용액 등을 사용하여 화학반응을 통해 제조되므로 다양한 반응간섭물질이 의약품 내 존재할 수 있다. 이에 본 연구에서는 방사성의약품에 존재하는 엔도톡신 시험의 반응간섭인자를 분석하고 이들의 허용범위를 평가하고자 하였다. 방사성의약품의 엔도톡신 시험을 위해 겔 응고 LAL시험과 비색 LAL시험을 실시하였고, 비색 LAL시험에서는 혈액 성분으로 만든 EndosafeⓇ LAL cartridge와 재조합 단백질로 만든 EndosafeⓇ rCR cartridge의 성능을 비교하였다. 방사성의약품 68Ga-DOTATOC 주사액의 엔토톡신 시험 반응간섭인자 평가 시 pH, 유기용매, 완충용액이 있었으며, 그 중 유기용매인 에탄올이 엔도톡신 시험에 간섭현상을 일으켰다. 하지만 68Ga-DOTATOC 주사액을 10배 희석할 경우 간섭현상을 극복할 수 있었다. 진단용 방사성의약품 내 존재할 수 있는 반응간섭인자들의 허용범위를 평가하였으며, pH의 경우 pH 4~8에서는 간섭현상이 없었고, 유기용매의 경우 에탄올 1% 이하에서는 간섭현상이 발생되지 않았다. 완충용액 HEPES는 2,000 ㎍/mL까지는 간섭현상이 발생되지 않았다. 본 연구를 통해 진단용 방사성의약품의 엔도톡신 시험에서 유기용매인 에탄올의 농도가 가장 중요한 반응간섭인자임을 확인하였고, 적절한 희석을 통해 1% 미만의 농도로 낮출 경우 엔도톡신 시험을 시행할 경우 간섭을 극복할 수 있음을 알 수 있었다. 또한 EndosafeⓇ LAL cartridge와 EndosafeⓇ rCR cartridge의 회수율도 비슷하게 측정되어 성능에 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 향후 새로운 진단용 방사성의약품의 엔도톡신 시험 시 반응간섭인자를 평가하는데 큰 도움이 될 것으로 기대한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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