• 한국식품과학회지
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• 제38권1호
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• pp.82-87
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• 2006

전통 청국장에서 protease 활성이 우수한 21개 균주를 ISP 배지를 이용하여 선발하였다. 선발된 21개 균주로 각각 청국장을 제조 후 관능 평가를 통해 청국장 특유의 이취와 비슷한 향을 생성하는 8균주를 선발 및 49개 탄소원의 이용성을 조사하여 Bacillus subtilis MB4와 B. amyloliquefaciens A1, A2, B1, MC1, SB2, SC1, SD1로 명명하였다. 최종적으로 우수한 균주로 선정된 MB4, A2와 SB2는 PCR sequencing(16S rDNA)에 의한 상동성을 비교하여 B. subtilis MB4, B. amyloliquefaciens A2, B. amyloliquefaciens SB2로 각각 동정되었다. B. subtilis MB4 및 B. amyloliquefaciens SB2로 제조한 청국장의 protease 활성은 179.6(Unit/mL/min)과 201.9(Unit/mL/min)로, 대조구의 97.0(U nit/mL/min)보다 우수했으며, 관능 평가는 B. subtilis MB4로 제조한 청국장이 3.6점의 평점을 얻어 전통 청국장과 가장 비슷한 향을 가진 것으로 평가 되었다. 겉보기 점도는 B. amyloliquefaciens SB2, MC1, B1, A1, SD1, A2, SC1로 제조한 청국장은 각각 0.010-0.013 Pa s (404/s)에서 0.008-0.006 Pa s(1001/s)로 감소하는 추세를 보였다. Bacillus subtilis MB4로 제조된 청국장과 대조구인 전통 청국장의 경우 각각 0.0008, 0.0006 Pa s(404/s)에서 0.0007, 0.0002 Pa s (1001/s)로 거의 변화가 없었으며, 이러한 결과는 B. subtilis MB4로 제조된 청국장과 대조구인 전통 청국장이 매우 유사한 물성을 가지는 것으로 판단된다.

• 한국축산식품학회지
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• 제30권5호
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• pp.804-810
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• 2010

This study was performed to select protease-producing Bacillus sp. as a potential probiotic starter for fermented meat products. In order to isolate protease-producing bacterium from meju, measured the diameter of the clear zone on agar plate (TSA, 1% (w/v) skim milk) and analyzed for intracellular protease activity, then 10 Bacillus-like strains were isolated. Three Bacillus-like strains (P19, P27, and P33) among 10 strains were able to tolerate in acidic condition (TSB, pH 2.5, 2 h incubation). These 3 strains were showed antimicrobial activity against food-borne pathogenic bacteria. These vegetative cells of 3 strains were showed a survival rate of 0.04% to 0.08% under the artificial gastric acidic condition (TSB, pH 2.5 with 1% (w/v) pepsin), but spore-forming cells were 56.29% to 84.77%. Vegetative cells of 3 strains were the least bile-resistant, while spore-forming cells of 3 strains showed higher survival rate more than 76% under artificial bile condition (TSB, 0.1% (w/v) oxgall bile). In these strains, P27 strain was finally selected as a good probiotic strain. P27 strain was tentatively identified as Bacillus amyloliquefaciens by API CHB kit and 16S rDNA sequence analysis. The results of this study suggest that B. amyloliquefaciens P27 can be used as a potential probiotic starter for fermented meat product.

• 한국식품영양과학회지
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• 제46권9호
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• pp.1114-1121
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• 2017

전통장류로부터 식품 유해요소를 생성하지 않는 Bacillus 균주를 분리하여 세포외효소 활성(amylase, protease, cellulase, xylanase)을 측정한 후, 단백질 분해 활성이 우수한 14개 균주와 비교균주 1균주를 선발하였다. 선발된 균주에 대해 16S rRNA 유전자를 이용한 균주 동정을 실시한 결과, B. amyloliquefaciens 10종, B. methylotrophicus 1종, B. velezensis 1종, B. subtilis 3종이 분리 동정되었다. 그중 B. subtilis JBG17019, B. amyloliquefaciens JBD17076, B. amyloliquefaciens JBD17109 균주에서 식중독미생물에 대한 증식 억제능이 확인되었다. Glutamic acid 대사와 관련한 발효특성을 확인하기 위하여 선발된 Bacillus 균주에 대해 glutamate, glutamine 및 ${\gamma}$-PGA 생성능을 측정하였다. 발효특성과 ${\gamma}$-PGA 생성능에 대한 다변량 요인분석을 주성분(PCA) 추출법으로 분석한 결과, PC1(효소 활성(amylase, cellulase, xylanase), PC2(${\gamma}$-PGA 생성능) 및 PC3(protease, glutamate 및 glutamine)의 3가지 주성분이 분류되었다. 주성분(PC)의 추출에 따라 B. amyloliquefaciens JBD17076 및 B. subtilis JBG17019 균주는 우수한 효소 활성 및 ${\gamma}$-PGA 생성을 하는 것으로 평가되었다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제54권2호
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• pp.133-139
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• 2012

Bacillus 균주가 생산하는 효소를 식품과 동물사료 첨가제로 이용하기 위해서 맥아로부터 단백질 분해능력과 전분 분해능력이 우수한 균주를 분리 동정하여 $Bacillus$ $amyloliquefaciens$ CNL-90으로 명명하였다. 분리된 $B.$ $amyloliquefaciens$ CNL-90이 생산하는 ${\alpha}$-amylase의 안정성은 pH는 7, 온도는 $40^{\circ}C$, protease의 경우는 pH가 7, 온도는 $50^{\circ}C$에서 안정했다. $B.$ $amyloliquefaciens$ CNL-90을 밀기울에 접종하여 고체 배양한 결과 ${\alpha}$-amylases의 효소활성은 6일 배양 후 290,000 unit/kg이었고, protease의 효소활성은 310,000 unit/kg으로 나타났다. 밀기울에 고체 배양한 생균수는 배양 6일 후에는 $2.2{\times}10^9$ CFU/g으로 높았다. 사료 요구율 개선은 $B.$ $amyloliquefaciens$ CNL-90 배양액 0.2% 첨가구가 대조구에 비해서 일당 증체량은 6.66% 높았고, 사료 요구율은 0.05% 효과가 있었다. 이러한 결과는 $B.$ $amyloliquefaciens$ CNL-90이 생산하는 단백질 분해효소와 전분 분해효소는 식품산업 및 가축사료 첨가제 산업에 응용할 수 있는 가능성을 확인하였다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제49권4호
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• pp.135-139
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• 2006

A alkalophilic strain, Bacillus licheniformis MH31 producing an alkaline protease was isolated from mine soil of Boryeong in Korea. Production of a high level of alkaline protease was achieved 42 h after incubation when the bacterium was grown at pH 9.0 and $35^{\circ}C$ in Horikoshi medium supplemented with 0.5%(w/v) starch and 1%(w/v) skim milk as carbon and nitrogen source, respectively. The molecular weight of partially purified enzyme was estimated to be 30 kDa by SDS-PAGE and its optimum pH was pH 10. The enzyme showed optimum temperature at $50^{\circ}C$, and was stable up to $60^{\circ}C$ after 1 h incubation. The protease was strongly inhibited by 1 mM of PMSF which was known well as strong inhibitor of serine proteases, but almost not inhibited by 5 mM of EDTA and 1,10-phenanthroline. When the protein hydrolysis products of 1% skim milk by partially purified protease was compared with available commercial proteases using HPLC analysis, most of hydrolysis products were detected below molecular weight of 10,000 and the hydrolysis ratio of purified enzyme was 24.8% lower than those(above 32%) of commercial proteases.

• Applied Biological Chemistry
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• 제31권4호
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• pp.356-360
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• 1988

토양에서 분리된 Alkaline Protease생산균주는 Bacills subtilis로 동정되었다. 본 균주의 최적배양온도는 최적 배지조건에서 $35^{\circ}C$이며, 초기 배지 pH는 10.5였다. 효소역가는 Casein-Folin법으로 약 2,300 Unit/ml로 나타났다. 배양액에 일련의 정제과정을 실시한 결과 정제배수 9.2, 회수율 14%의 정제효소를 얻었으며, 분자량은 19,000이었다. 정제효소의 반응최적온도는 $70^{\circ}C$, 최적 PH는 12였다. $Fe^{++}$에 의해 활성이 저하되었으며, 또한 serine protease inhibitor인 PMSF에 의해 활성이 저해되었다. 이것으로 부터 본 효소는 활성부위에 serine을 갖는 serine protease의 일종임을 알 수 있었다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제51권6호
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• pp.527-536
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• 2009

A potent protein degrading bacterium was isolated from soil samples of different environments. Polyphasic taxonomic studies and phylogenetic 16S rRNA sequence analyses led to identify the isolate IB No. 11 as a strain of Bacillus subtilis. The isolated strain was recognized to produce protease constitutively, and the maximum production (1.64 units/ml) was attained in a shake flask culture when the isolate was grown at $40^{\circ}C$, for 32 h in basal medium supplemented with starch (0.25%) and gelatin (1.25%) as sole carbon and nitrogen source, respectively. The optimum pH and temperature for the protease activity were determined to be pH 7.0 and $50^{\circ}C$, respectively. $Ca^{2+}$ and $Mn^{2+}$ enhanced remarkably the protease activity but neither showed positive effect on the protease's thermal stability. In addition, it was observed that the protease was fairly stable in the pH range of 6.5-8.0 and at temperatures below $50^{\circ}C$, and it could be a good candidate for an animal feed additive. The inhibition profile of the protease by various inhibitors indicated that the enzyme is a member of serine-proteases. A combination of UV irradiation and NTG mutagenesis allowed to develop a protease hyper-producing mutant strain coded as IB No. 11-4. This mutant strain produced approximately 3.23-fold higher protease activity (6.74 units/mg) than the parent strain IB No. 11 when grown at $40^{\circ}C$ for 32h in the production medium. The protease production profile of the selected mutants was also confirmed by the zymography analysis.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제17권3호
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• pp.410-417
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• 2010

우리나라 전통발효식품의 하나인 청국장으로부터 고 비활성 세포외 protease 생산능이 우수한 균주를 분리하고 그 특성을 조사하였다. 분리된 균주 중 D14 균주 배양 상징액의 protease 활성이 15.2 U/mL로서 가장 강하였으며 비활성 또한 40.0 U/mg protein으로서 가장 강하게 나타났다. 이 균주의 특성을 조사한 후 Berge's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 Bacillus subtilis로 동정하였다. 균주 D14의 16S rDNA 염기서열을 분석하여 B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 균주와 99.9%의 상동성을 가짐을 확인 하였다. 또한 16S rDNA의 염기서열을 토대로 계통분석을 통하여 다른 Bacillus sp.의 균주들보다 NCIB 3610 균주와 유전적으로 매우 가까운 관계에 있음을 확인하였다. Soluble starch는 사용한 탄소원 중 가장 높은 수준의 protease 생산능을 보였으나 단당류, 이당류 등은 모두 효소 생산능에 대하여 저해효과를 나타내었다. 특히 fructose를 첨가한 경우에는 12.7%, glucose를 첨가한 경우에는 35.9% 수준의 효소 생산능을 나타내었다. 질소원의 경우는 soytone의 첨가구에서 대조구에 비하여 약 61.4% 수준의 효소활성을 나타내어 저해효과가 가장 높았으며 다른 질소원은 효소 생산에 크게 영향을 미치지 않았다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권6호
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• pp.545-551
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• 1989

알칼리성 Bacillus속 8-16 균주의 내열ㆍ알칼리성단백질 분해효소를 정제하여 그 특성을 조사하였다. 본 균주의 알칼리성 protease를 아세톤침전, CM-셀룰로즈크로마토그래피, Sephadex G-100 및 G-75 젤 여과법으로 정제하였고 비활성이 37배되게 하여 단일단백질이 될 때까지 순수정제하였다. 이 효소는 7$0^{\circ}C$ pH 11에서 pH 12 사이에서 최대 활성을 나타냈고 6$0^{\circ}C$에서는 한시간 동안 안정하였다. 이 효소의 $K_m$치는 1.3mg/$m\ell$이며 분자량 33,000으로 추정된다. 또한 이 효소는 Cu$^{2+}$ 및 Mn$^{2+}$에 의해서 약간 활성화되고 Ag$^+$, Hg$^{2+}$ 및 PMSF에 의해서 저해되므로 활성부위에 serine기가 관여하는 것으로 추정된다.

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.397-402
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• 2009

청국장에서 혈전 용해능이 우수한 균주를 분리하기 위해 짚을 이용하여 직접 청국장을 제조하였으며 이로부터 1, 000여종의 균주를 1차적으로 분리하였다. 2차적으로 skim milk가 첨가된 배지 및 fibrin 배지의 단백질분해 실험을 통해 혈전 용해능이 우수한 균주를 분리하였다. 이 과정을 통해 선발된 균주는 J-1, J-2, J-3, J-4, J-5로 명명된 5종 균주이었으며 그 중 Bacillus 계통의 J-4 균주가 가장 활성이 높은 균주로 선별되었다. Bacillus subtilis J-4 균주가 생산하는 protease를 DEAE-sepharose column을 사용하여 부분 정제 분리한 결과 SDS-PAGE Gel 상에서 45.0 kDa의 질량이었다. 이 단백질을 MALDI-TOF 및 PMF(Peptide Mass Fingerprinting)를 사용하여 분석한 결과 neutral protease와 bacillopeptidase F가 확인되었다.