• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제21권4호
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• pp.494-498
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• 2008

MTT (3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide) reduction assay is a method that validates the viability of an active cell. Dehydrogenase in mitochondria converts yellow colored insoluble tetrazolium salt to purple colored water-soluble formazan. Sperm also have mitochondria in the midpiece, therefore sperm viability could be evaluated by MTT reduction assay. Several studies have already demonstrated the capability of application of the MTT reduction assay to sperm of several species in Hepes-BSA buffer. Because most liquid semen was diluted in extender like BTS (Beltsville Thawing Solution), Modena or Androhep when it is used or transferred, semen needed another dilution in Hepes-BSA buffer to assess sperm viability. In this study, we evaluated boar sperm viability especially in BTS extended semen and compared the efficiency of this test with eosin-nigrosin staining. We used the fresh BTS extended semen from a local A.I center. Semen sample was diluted to $3.0{\times}10^7$ sperms/ml in BTS. The rates of formazan production were measured in 96-well microtiter plates immediately and 1h after incubation at $17^{\circ}C$ using a spectrophotometer at wave length 560 nm. Simultaneously, split samples of the same semen were tested, using eosin-nigrosin staining to compare the efficiency of the MTT assay of sperm viability in BTS. The correlation between the results of these tests was calculated using Student-t test and ANOVA. The results revealed a strong correlation between the results of MTT reduction rate and the results that were simultaneously determined by eosin-nigrosin staining at 1 h. In conclusion, the MTT reduction test was an effective and simple method to validate sperm viability and it could be used as a simple tool to evaluate sperm viability in the local A.I center and laboratory.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권4호
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• pp.247-252
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• 2005

The purpose of this study was to assess sperm quality during in vitro storage of miniature-pig semen in order to determine which extender should be used and how extender can be diluted for in vitro storage of miniature-pig semen. Freshly ejaculated miniature-pig's semen was diluted with same volumes of Beltsville Thawing Solution (BTS), Androhep, Modena, Mulberry III and modified-Modena extenders. Sperm quality was evaluated by examining viability, motility, abnormality, acrosome intactness, intensity and capacitation status by chlorotetracycline (CTC) staining. Sperm motility decreased with storage period prolonged and differences among BTS, Androhep, Modena and Mulberry III were apparent On Day 1, approximately 80% of the sperm were motile, but motility decreased to $40\%$ at Day 7. During the 7 days of storage, sperm survival in modified-Modena B extender was higher than another extenders. However, it was not differ significantly among other extenders. The percentage of F and B patterns were not differ significantly among the extenders. However, F pattern in modified-Modena B extender was slightly higher until 3 days of storage than that of Modena extender, modified-Modena A extender and modified-Modena C extender. The percentage of AR patterns in modified-Modena B extender was slightly lower, but did not differ significantly among other extenders. The results of present study suggest that modified-Modena B was effective as new extender for in vitro storage of miniature-pig semen.

• 한국임상수의학회지
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• 제18권4호
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• pp.345-349
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• 2001

The aim of this study was to investigate the effect of sperm preservation according to the various kinds of commercially available semen extenders and to investigate the effect of sperm preservation according to the various temperature storages of fresh-extended porcine semen. To investigate the effect of sperm preservation according to the various kinds of commercially available semen extenders, porcine semens diluted in 3 semen extenders, Beltsville Thawing Solution(BTS), Androhep and Kiev, were cooled at $8^{\circ}C$ storage temperature with a controlled cooling rate of $2-4^{\circ}C$/h. Motility, progressive motility, normal sperm(%) and sperm morphology were assessed comparatively. In motility and progressive motility, Androhep extenders revealed better result than other extenders. In normal sperm(%) and sperm morphology, 3 semen extenders revealed similar results. To investigate the effect of sperm preservation according to the various temperature storages of fresh-extended porcine semen, porcine semens diluted in BTS extender, were cooled at 3 storage temperatures($8^{\circ}C$, $12^{\circ}C$ and $17^{\circ}C$) with a controlled cooling rate of $2-4^{\circ}C$/h. Motility, progressive motility, normal sperm(%) and sperm morphology were assessed comparatively. In motility and progressive motility, $8^{\circ}C$ treatment group revealed better result than $12^{\circ}C$ and $17^{\circ}C$ treatment groups. In normal sperm(%) and sperm morphology, 3 temperatures of treatment groups revealed similar results.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.9-16
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• 2002

돼지 인공수정센터에서 사육중인 인공수정용 종모돈을 이용하여 1995년부터 2000년까지 보존액 종류, 보존온도 및 보존기간에 따른 정액성상 변화와 번식성적을 조사하여 돼지 인공수정시 번식성적 향상과 실용화에 기여코자 본 연구를 실시하였다. 1. 돼지 액상정액의 보존액 종류에 따른 보존기간별 활력은 Androhep 보존액은 3일째부터, BTS 및 Modena는 5일째부터 현저하게 감소하는 경향을 보였고 (P＜0.05), pH변화는 6.24~7.06 범위에서 변이가 심하게 관찰되었으며 Androhep 보존액이 산도가 낮은 경향을 보였으나 전반적으로 규칙 적 인 경향을 나타내었다. 보존액 종류별 보존기간에 따른 분만율은 BTS, Modena 및 Androhep 보존액 모두 5일 보존까지 차이가 없었다. 보존액별 분만율은 Androhep 보존액이 BTS 보존액과는 차이가 없었으나 1일 보존과 5일 보존에서 Modena보존액 보다 우수하였다 (P＜0.05). 산자수는 보존 기간별 보존액간에 차이는 없었으나 Androhep 보존액은 3일 보존부터 산자수가 유의적으로 감소하였다 (P＜0.05). 2. 보존온도에 따른 액상정액의 운동성과 정상첨체 비율에서 17$^{\circ}C$ 보존정액의 운동성은 3일째부터, 정상 첨체율은 4일째부터 감소하였으나 5$^{\circ}C$ 보존정액은 4일 보존까지 정액성상의 변화가 크지 않은 것으로 나타났다. 17$^{\circ}C$에 보존한 액상정액이 5$^{\circ}C$에 보존한 것보다 분만율은 현저히 높았으나 산자수는 비슷한 경향을 보였고, 분만율은 보존 2일째부터 산자수는 3일째부터 감소하였다. 5$^{\circ}C$ 보존정액은 4일까지 분만율에 큰 변화가 없었으나 산자수는 다소 감소하는 경향을 보였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.405-410
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• 1998

본 연구는 독자 개발한 돼지액상정액희석제 Kp(한국생명과학연구소)에 pH를 안정화하여 보존 중 정자의 운동성을 유지시킬 수 있도록 EDTA, Tris, Citrate buffer의 적정 첨가농도를 결정하고자 실시하였다. Basic Kp와 BTS (Mini-tube, Germany; BT-Sg), BTS (Tri-bio, USA; BTSa), Modena (SGI, USA)를 17$^{\circ}C$ 에서 각각 보관한 경우 모든 희석액에서 시간 경과에 따라 pH가 증가하였고, Basic Kp 는 희석 당일의 pH가 다른 희석액에 비해 높게 나타났는데 이것은 돼지액상정액의 생리적인 pH인 6.8~7.5에 비해서도 높은 수준이었다. 정액내의 pH 저하를 방지해 주고 정액의 생리적인 pH를 유지하기 위하여 Basic Kp에 EDTA, Tris, Citrate buffer를 단계적으로 첨가하면서 시간 경과에 따른 pH 변화를 살펴 본 결과 1.25g /L EDTA, 1.42g /L Tris, 1.00g /L Citrate를 첨가한 경우 (Modified Kp) pH는 l일째 6.88에서 6일째 7.33으로 유지되었다. 특히, Modified Kp에 첨가된 buffer 의 농도는 Modena와 다른 희석제에 첨가된 농도에 비해 1/2 에서 1/4 정도로 낮은 수준이었다. Modified Kp 와 Basic Kp, BTSg, BTSa 및 Modena로 냉동-융해된 돼지 정자를 희석하여 보존한 경우 정자의 운동성은 Modified Kp가 다른 희석액에 비해 유의하게 높게 나타났다(87.0% vs. 71.0~48.0% in day 1; 13.3% vs. 6.3~0% of day 6), 이상의 결과를 종합해 볼 때, Modified Kp는 낮은 농도의 EDTA, Tris, Citrate buffer 첨가에도 불구하고 돼지정자의 생리적인 pH 수준을 잘 유지할 수 있었으며, 수입되어 냉동-융해된 돼지 정자에 사용하는 희석제 BTSg, BTSa, Modena 보다도 정자의 운동성에 효과적이었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권3호
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• pp.257-262
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• 1999

본 연구는 독자 개발한 돼지인공수정용 희석액 KpA를 실용화하기 위하여 온도와 pH 변화가 KpA의 정자보존능력에 미치는 영향을 알아보고자 실시하였다. 요크셔 계통의 종웅돈에서 채취한 신선정액을 KpA와 BTS으로 희석한 다음 17$^{\circ}C$에 1주일간 보존하면서 생존율과 pH 변화폭을 조사한 결과 KpA 희석정액은 BTS 희석정액보다 보존기간 동안에 높은 생존성을 나타내었으며, 5일까지 60% 이상의 생존율을 유지하였다. 또한 두 희석액과 희석정액 모두 보존 중 생리적인 pH 범위내에서 안정하였다. 희석액 KpA의 pH를 산성 (pH 6.3~6.8), 중성 (pH 6.8~7.3), 염기성화 (pH 7.8~8.0) 으로 조정한 다음 신선정액과 희석하여 4$^{\circ}C$, 17$^{\circ}C$ 및 37$^{\circ}C$에서 보존한 결과 희석정액의 pH 는 급격한 변화 없이 안정하였으나 중성에서 보다 산성과 염기성의 환경에서 더 완만한 변화를 보였다. 또한 희석액을 산성화 또는 염기성화 하였을 때 정자가 받는 스트레스는 17$^{\circ}C$보다 4$^{\circ}C$와 37$^{\circ}C$에서 더욱 현저히 나타났다. 따라서 KpA 는 17$^{\circ}C$ 보존에 적합한 희석액이며, 보존 중 정자의 생존율을 높게 유지하기 위해서는 희석정액의 pH 와 보존온도의 조화가 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.241-246
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• 2010

The objective of this study was to investigate the effect of storage time on fresh boar semen in Androhep and Beltsville Thawing Solution (BTS). Boar semen samples extended in each extender were stored at $17^{\circ}C$ up to 4 days. Sperm motility kinematics was evaluated by computer assisted sperm analyzer (CASA) and capacitation status by chlortetracycline (CTC)/Hoechst 33258 staining. Sperm motility (%) was not decreased during storage in BTS and Androhep. No significant difference between extenders was observed. Only significant differences in kinematic parameters on linearity during storage were found. The percentage of dead sperm significantly decreased during storage (p<0.05). Also the percentage of noncapacitated, capacitated, and acrosome-reacted sperm significantly modified during storage (p<0.05). However, there was no significant difference between extenders except proportion of capacitated sperm. This finding supported that modification in these parameters was not significantly different between extenders during this short-term storage. Our finding strongly indicated that both Androhep and BIS maintained favorable conditions for motility, motility kinematics, and capacitation status during short-term storage. Despite modifications in some parameters were apparent during sperm storage in extenders, these may not affect the fertilizing capacity of boar semen.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권1호
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• pp.59-64
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• 2008

본 연구는 정액의 보존 기간 동안 정액의 질적 변화를 알아보고자 시행하였다. 돼지 정액을 Beltsville Thawing Solution (BTS)에 희석한 후 $17^{\circ}C$에서 5일 동안 보존하였다. 보존 기간 동안 정자의 운동성(%)과 linearity는 3일째부터 유의하게 감소하였으나, 다른 운동 역학 변수에서는 유의적 변화를 나타내지 않았다. 또한, 5일 동안 정액을 보존할 경우 첨체의 온전성에도 변화가 없었다. 그러나 제 4일째부터 첨체 변화가 야기된 정자는 유의적으로 증가하였으나, 수정능 획득이 일어난 정자는 유의적으로 감소하였다. 정액의 보존 기간 동안 첨체의 온전성의 유의적 변화가 없었다. 즉, 보존 기간 3일동안 정자의 질적 운동성 및 첨체 온전성에는 유의적인 변화가 없었으므로 상업용 돼지 액상정액은 $17^{\circ}C$에서 적어도 3일간 수정능력을 만족스럽게 유지함을 보여준다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.77-77
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• 2001

본 연구는 돼지 동결정액의 번식성적을 개선코자 기존의 maxi-straw와 cryogenic-vial을 이용하여 포장방법에 따른 동결방법과 융해방법별 정액성상 및 번식성적을 비교하였다. 동결방법은 두 가지 포장방법 모두 정액의 양(5$m\ell$)과 농도(5.0$\times$$10^{9}$/dose)가 동일한 조건으로 처리하였으며, LYE(Lactose egg york extender) 보존액으로 희석하여 액체질소 상단 15cm에서 20분간 동결하였다. 융해방법은 maxi-straw는 52$^{\circ}C$에서 45초간 cryogenic-vial은 52$^{\circ}C$에서 190초간 융해하여 $25^{\circ}C$로 가온 된 80$m\ell$ BTS (Beltsville thawing solution) 보존액과 혼합하였다. 정액성상검사는 정자자동분석기(SAIS : Sperm Analysis Image System, Korea)를 이용하였다. 총활력(TM : Total motility)과 정자의 빠르기(VCL : Curve linear velocity)는 maxi-straw가 54.3%와 46.6%로 cryogenic-vial의 35.6%와 36.6%보다 우수하였다(P<0.05). 정자의 직진성(STR : Straightness)과 NAR은 maxi-straw가 53.2%와 32.6%로 cryogenic-vial의 47.3%와 29.8%와 비슷한 경향을 나타내었다. 수태율과 분만율 및 총산자수는 maxi-straw가 77.3%, 68.2% 및 8.0두로 조사되어 cryogenic-vial포장방법의 66.7%, 61.9% 및 7.4두보다 다소 우수하였으나 통계적인 유의차는 인정되지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 cryogenic-vial방법이 새로운 돼지 동결정액 포장방법의 가능성을 나타낸다고 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.17-23
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• 2002

본 연구는 지금까지 돼지 난포란 성숙을 위해서 많이 사용하고 있는 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지를 비교하고 액상정액을 이용한 체외수정 방법을 개발하고자 실시하였다. 미성숙 난포란은 0.5 $m\ell$의 성숙배지에 각 well 당 30~40개씩 적하하였고, 38.5$^{\circ}C$, 5% CO2, 95% 공기로 조절된 CO2 배양기에서 44시간 성숙 시켰다. 미성숙 난포란을 mTCM-199, mWaymouth MB 752/l 그리고 NCSU-23 성숙배지에서 44시간 배양한 결과 CVBD 발생율은 각각 95.6, 94.1 그리고 94.9%였으며, MH단계까지의 성숙율은 각각 92.5, 90.1 그리고 91.1%였다. 성숙배지별, GVBD 발생율과 MH까지의 성숙율간에 유의성은 인정되지 않았다. 액상정액의 제조용 정액은 90% 이상의 운동성을 가진 농후정자부분을 사용하였으며 정액 채취 후 2시간 동안에 22~24$^{\circ}C$의 실온까지 냉각시켰다.실온까지 냉각한 정액은 BTS 희석액으로 2$\times$$10^{8}$ $m\ell$ 정자농도로 조정하여 100 $m\ell$ 플라스틱병에 30 $m\ell$씩 주입하여 17$^{\circ}C$에서 5일간 보관하였다. 5일 보관 후 운동성이 70% 이상인 정자를 체외수정에 이용하였다. 성숙 후 cumulus cell들이 제거된 성숙난포란은 0.5 $m\ell$의 mTCM-199 또는mTBM 수정배지에 30~40개씩 적하하고, 최종정자농도를 2$\times$$10^{6}$$m\ell$되도록하여 6시간 동안 수정시켰다. 체외수정시킨 수정란들은 0.5 $m\ell$의 NCSU-23 배양배지에서 수정 후 6시간 배양하여 정자침입율, 다정자침입율 그리고 웅성전핵형성율을 조사하였고, 수정 후 45시간 배양하여 난할율을 조사하였다. NC-SU-23 성숙배지와 mTBM 수정배지를 이용하였을때 웅성전핵형성율이 48.0%로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 mWaymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정배지를 이용하였을 때보다 웅성 전핵 형성율이 높았다. 2~4세포기까지의 난할율은 mTCM-199 성숙, 수정 및 배양배지에서 24.1%, mWaymouth 752/1 성숙배지, mTCM-199 수정 및 배양배지에서 43.6%, 그리고 NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 WCSU-23 배양배지를 이용한 것이 71.2%였다. 이상의 결과를 종합하면 BTS 희석액으로 17$^{\circ}C$에서 5일 보존한 액상정액으로 체외수정이 가능함을 입증하였고, NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 NCSU-223 배지가 미성숙 난포란의 성숙, 수정 및 배양에 우수한 배지임을 입증하였다.