보리로부터 분리한 Fusarium sp. BYA-1균주의 감자한천배지 배양체로부터 여러 식물병원곰팡이에 길항력을 나타내는 세 개의 항생물질을 분리하였다. 추출한 세 개의 항생물질은 silica gel관 크로마토그래피와 분취 HPLC, 그리고 Phytolhthora capsici 검정을 이용하여 정제하였다. 이들 분리한 항생물질들을 동정하기 위하여 융점 결정, 자외선흡광법, 질량분석 및 핵자기공명법 등의 기기분석을 실시하였다. 그 결과, 세 개의 항진균성 항생물질들은 fusarielin A, enniatin B, 그리고 enniatin B\ulcorner으로 각각 동정되었다. 분리한 세 개의 물질 중 fusarielin A가 공시된 곰팡이에 가장 강한 항균활성을 나타내었으며, 최소저해농도는 40$\mu\textrm{g}$/ml이하였다. Fusarium속 균주가 구조적으로 다른 두 종류의 항진균성 항생물질인 fusarielin A와 enniatins을 동시에 생성한다는 것은 본 논문에서 처음으로 보고하는 것이다.
목질자원으로부터 Botrytis속 곰팡이병에 대하여 항균활성을 나타내는 추출물을 탐색하고자 본 연구는 시도되었다. 신갈나무를 고압 전처리하고 이로부터 열수, 메탄올, 에탄올을 이용하여 목질 추출물을 획득하였다. Botrytis속 곰팡이 3종은 $20^{\circ}C$와 $25^{\circ}C$의 생장온도에서 최적 생장을 하였으며 pH 5.0과 7.0에서 가장 양호한 균사 생장을 나타냈다. 열수 추출물이 Botrytis속에 대하여 가장 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다. 열수추출물로부터 항균물질을 분리하기 위하여 n-hexane : chloroform : ethyl acetate : formic acid (12 : 17 : 8 : 0.2, v/v/v/v)를 용제로 하는 silica-gel column chromatography와 TLC를 사용하였으며, 3종 추출물들은 HPLC 분석을 통하여 화합물을 확인하였으며 UV Spectrophotometer를 이용하여 열수 추출물로부터 6개의 fraction group을 분리 하였다. 6개의 fraction group의 항균활성 test결과, fraction group I과 II는 Botrytis cinerea에 대하여 가장 높은 항균활성을 나타냈다. Fraction group의 HPLC 분석결과, 3개의 유효물질을 확인하였으며 이 3가지 물질이 항균활성에 영향을 미친다고 추측된다.
본 연구는 항진균성 천연물 의약품을 개발하기 위한 생물자원의 연구로서 미나리아재비과에 속한 여러 한약재의 항진균활성을 새롭게 검증하고 비교하는 것을 목표로 한다. 한약재에서 진균류 생장을 저해하는 물질을 효과적으로 추출하는 방법을 찾고 추출물들에 포함된 항진균성 유용 물질을 탐색하였다. 위령선, 황련, 백두옹 한약재의 열수 추출 및 유기용매 추출을 진행하여 액체배지에서 항진균활성을 측정하였을 때 클로로포름 분획물에서 효과적인 결과를 얻었다. 또한 단세포성 진균인 Candida albicans, Candida tropi- calis, Candida lusitaniae 그리고 사상성 곰팡이인 Pythium ultimum KACC 40705, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum을 대상으로 고체배지에서 disc diffusion 실험으로 진균 성장 저해 실험을 수행하였다. 백두옹 추출물은 Candida spp.에 대해서, 위령선은 사상성 곰팡에 대해서 우수한 항진균활성을 가지고 있다는 것으로 확인했다. 마지막으로 추출물에 존재하는 항진균성 유용물질을 탐색하기 위해 GC-MS 분석을 진행하였다. 연구 결과 미나리아재비과의 한약재에서 항진균활성을 확인할 수 있었으며 위령선에서 thur- berogenone, 황련에서 16-HCDO를 항진균성 후보물질로서 확인하였다. 결론적으로 백두옹, 위령선 및 황련은 다양한 진균류에 대하여 항진균활성을 가지고 있음을 확인하였으며, GC-MS 분석에서 세 한약재 모두 서로 다른 항진균성 후보물질을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 미나리아재비과 생물자원이 진균류 저항성에 대해 여러 방향으로 진화되었음을 나타낸다.
본 연구에서는 고추재배 지역의 오염지 토양으로부터 탄저병원균인 Colletotrichum gloeosporioides에 대하여 항진균 활성이 우수한 균주를 분리하였다. 분리 균주의 생화학적 특성을 조사한 결과 내생포자를 형성하는 Gram-positive이며, 세포크기는 $2.5{\sim}3.0{\times}1.5{\mu}m$으로 짧은 간균으로 siderophore, cellulase와 IAA (Indole-3-acetic acid)을 생산하였다. 16S rRNA 유전자염기서열 분석 결과 Bacillus sp.와 99%의 상동성을 나타내어 Bacillus sp. CS-52로 명명하였다. Bacillus sp. CS-52의 항진균 활성 물질을 생산하기 위한 배양 최적 조건은 0.5% glucose, 0.7% $K_2HPO_4$, 0.2% $K_2HPO_4$, 0.3% $NH_4NO_3$, 0.01% $MnSO_4{\cdot}7H_2O$, 0.15% yeast extract, pH 7과 $30^{\circ}C$로 조사되었으며, 최적화된 배양조건에서 36시간에 최대 성장을 보이며, 고추 탄저병원균에 대하여 60시간 배양조건에서 가장 높은 13.3 mm의 항진균 활성을 보였다. 포자발아억제력은 48시간에 가장 높은 억제력이 보였고, siderophore는 최종배양시간 72시간까지 생성됨을 확인하였다. 식물생장조절물질 IAA와 활성효소인 cellulase의 경우 배양시간 24시간에 최대 생성됨을 확인하였으며, C. gloeosporioides에 대한 실내에서의 항진균활성 검증결과 화학농약 보다 더 높은 70%의 방제가를 나타내었다. 향후 Bacillus sp. CS-52 균주와 배양액을 이용하여 생물학적 친환경방제제로의 제품화가 가능할 것으로 사료된다.
Selective culture of actinomycetes from soil microbes and their antibiotic producing characters by agar-disk method were examined. Some of the organisms which produced antibiotics on agar disk did not produce antibiotics in liquid culture. Further examination indicated that production of antibiotic was dependent on the composition of medium. Many streptomycestes produced antibacterial substances in tryptic soy broth but others produced antifungal antibiotics in V-8 broth. Production of antibacterial substances by Streptomyces sp. was also dependent on the medium composition.
한국산 흰주름버섯외 50종 버섯을 채집하여 석유에테르, 80%에탄올 및 멸균증류수로 각각 추출하여 153종의 추출물을 얻어 식물병원성 곰팡이에 대한 항균활성을 검색하였다. A. alternata에 항균활성은 독우산광대버섯의 물 추출물, MPC-3 버섯의 에탄올 추출물 그리고 큰낙엽버섯과 Xanthoconium affine의 석유에테르 추출물이 활성을 보였다. 잔디탄저병균, C. graminicola에 대하여는 애광대버섯, 노란길민그물버섯 그리고 흰둘레무당버섯의 석유에테르 추출물이, 해면버섯, MPC-3 버섯 그리고 주걱송편버섯의 에탄올 추출물이, 조개껍질 버섯의 물 추출물이 각각 항균활성을 보였다. 인삼뿌리썩음병균, C. destructans에 대하여는 애광대버섯, 수원그물버섯, 해면버섯, MPC-3 버섯, 주걱 송편버섯, 띠미로버섯 그리고 외대덧버섯의 에탄올 추출물이, 애광대버섯, 흰둘레무당버섯, 향버섯, 큰낙엽버섯의 석유에테르 추출물이 각각 항균활성을 보였다. 오이덩굴쪼김병균, F. o. cucumerinum에 대하여는 MPC-3 버섯의 에탄올 추출물이 항균활성을 보였다. 감자시들음병균, F. solani에 대하여는 진갈색주름버섯의 물 추출물이 그리고 무변색무당버섯의 에탄올 추출물이 각각 항균활성을 보였다. 잔디탄저병균, I. bolleyte에 대하여는 진갈색주름버섯의 물 추출물이 그리고 MPC-3버섯의 에탄올 추출물이 각각 항균활성을 보였다.
유도된 집파리유통 hemolymph중에서 Candida albicans의 3가지 anti-fungal peptides를 분리하였다. 3개 anti-fungal peptides는 분자량이 4-16 kDa 사이의 분명한 구별이 있을 뿐만 아니라, 각 peptide는 anti-fungal peptides작용이 있었다. 이들 peptide의 공통 특징은 모두 열을 받은 뒤 활성이 변하지 않는 비교적 강한 내열성을 보여주었다.
국내산 무의 추출물을 여러가지 Column과 HPLC를 이용하여 잿빛곰팡이 병원균에 대한 항 진균성 물질을 분리하였다. 투석튜브를 이용한 분리에서 이물질이 3.5kDa 이하의 저분자물질이며 또한 내열성 물질임을 확인하였다. 이물질들은 최소한 5종의 물질로 구성되어 있으며 이중 가장 항진균성이 강한 물질을 HPLC를 이용하여 순수 분리하였으며 잿빛곰팡이병에 감염된 식물에 적용한 결과 농약과 비슷한 효과를 나타내어 환경 친화적인 항진균 물질로서 사용가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 안전하고 효율적인 항진균제 개발 연구의 일환으로 73종의 약용 및 식용식물의 메탄올 추출물을 조제하고 이들의 hexane, methylene chloride, ethylacetate, butanol 분획물 및 water 잔류물 365종을 각각 조제하여 Aspergillus niger에 대한 항진균력을 조사하였다. 활성 선별단계에서 비교적 경제적이면서도 손 쉬운 순차적 유기용매 분획물을 제조하여 항진균 천연물 탐색을 시도함으로서 기존에 천연물 추출물에서 검색되지 않은 참나물, 뽕나무, 단삼의 항진균 활성을 확인하였다. 특히 항진균 활성이 보고된 바 없는 참나물의 경우 methylene chloride 분획에서 A. niger에 대한 MIC, MFC 가 각각 0.25 및 0.5 mg/mL임을 확인하여 강력한 항진균 활성을 확인하였으며, 0.25 mg/mL 농도에서 포자발아 억제활성도 나타냄을 확인하였다. 또한 활성분획은 0.5 mg/mL농도까지 인간 적혈구에 대해 용혈활성을 나타내지 않았으며, 활성물질은 당이 결합된 flavonoid로 추측되었다. 본 연구결과는 참나물 methylene chloride 분획의 우수한 항진균 활성을 제시하며, 비교적 간단한 유기 용매 분획법을 이용한 천연물 시료제조 및 이를 이용한 활성탐색이 새로운 활성물질 선별에 효과적임을 제시하고 있다.
항생제 및 항진균제 개발에 있어 미생물 유래 천연 생리활성물질 분리를 통한 선도물질을 확보하는 일은 매우 중요하며, 신규 물질을 확보하기 위해 꾸준한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 천연 항생물질의 개발을 위한 연구의 일환으로 태백산 일대의 토양에서, 인체에 다양한 감염증을 유발하는 효모와 곰팡이에 대하여 강한 항진균 활성을 나타내는 BCNU 2003 균주를 분리하여 항진균 활성 물질의 이용가능성에 대해 연구하였다. BCNU 2003은 계통적으로는 B. amyloliquefaciens와 B. vallismortis의 subcluster에 속하는 균주로 동정되어 Bacillus sp. BCNU 2003으로 명명하였다. 항균물질 분리를 위해 ethyl acetate (EA) 추출물과 펩타이드 추출물로 나누어 그람양성 세균, 그람음성 세균 및 진균에 대한 항균활성을 측정한 결과, EA 추출물이 6종의 인체병원성 진균에 대해 모든 높은 항진균 활성을 나타내었다. 특히 기회성 감염을 유발하는 A. niger, C. albicans 그리고 Sa. cerevisiae에 대해 높은 억제 활성을 나타냈으며, 균배양액에서 낮은 저해율을 보였던 Ep. floccosum에 대해서도 EA 추출물은 높은 활성을 나타내었다. 따라서 다양한 인체 병원성 진균에 대해 넓은 항균스펙트럼을 가지는 Bacillus sp. BCNU 2003 균주의 활성물질 분리를 통해 특정 항균 및 항진균 물질의 대량생산 조건 등의 추가적인 연구를 수행한다면, 인체 감염증을 포함한 광범위한 피부치료제의 응용개발이 가능하리라 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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