• 한국수정란이식학회지
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• 제18권3호
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• pp.171-178
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• 2003

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵 난자의 극체 와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono-phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다. 활성화된 수정란은 38.5$^{\circ}C$, 90% $N_2$, 5% $CO_2$로 조정된 배양기에서 처음 3일은 0.3% BSA가 첨가된 CR1-aa 배양액에서, 배양 4일째부터는 10% FBS가 첨가된 CR1-aa 배양액에서 배양을 실시하였다. 본 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 전기자극 융합방법에 따른 수핵난자의 융합율과 lysis율은 electric chamber를 이용하여 간접융합을 실시하였을 경우 51.6%와 10.7%를 보였고, needle을 이용하여 직접 융합을 실시하였을 경우 68.9%의 융합율과 11.5%의 lysis율을 보임으로써 needle을 이용한 직접융합 방법이 유의적으로 높은 융합율을 보였다(P<0.05). 융합 후 체외 발달과정을 살펴보면 난할율에 있어서 needle을 이용했을 시 80.3%로 chamber를 이용했을 시 73.2%보다 유의적으로 높은 난할율을 보였다. 초기배 발달단계인 2∼4세포기의 발달율 역시 needle을 사용한 구가 61.1%로 chamber를 사용한 구 54.1%보다 유의적으로 높은 차이를 보였다. 상실배 단계는 chamber를 사용한 구가 6.7%로 needle을 사용한 구 6.2%보다 약간 높았지만 유의적인 차이는 없었다. 하지만 이식 가능한 단계인 배반포배 발달율에 있어서는 needle을 사용하여 융합을 시도한 구가 26.3%로 chamber를 사용한 구 18.4%보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(P<0.05). electric chamber를 이용하여 전기융합을 시도시전류가 흐르는 wire와 주입된 체세포가 직각을 이루도록 정렬을 시키느라 많은 시간이 소요되고, 주입한 체세포가 세포질과 떨어진 난자는 전기자극을 주어도 융합이 일어날 수 없으며, 높은 전압을 사용하기 때문에 융합된 복제란의 lysis가 많이 발생하는게 가장 큰 단점으로 꼽을 수 있다. 하지만 미세조작기와 needle 방법을 이용하면 낮은 전압을 이용하여 융합을 시도하기 때문에 복제란의 lysis를 줄일 수 있고, 전극과 체세포 주입란을 정렬시키는 과정이 생략되어 시간이 절약되며, 결정적으로 주입된 체세포가 세포질과 떨어져 있더라도 미세조작기로 약간의 압력을 가하여 전기자극을 가할 수 있어서 보다 높은 융합율과 배반포배 발달율을 얻을 수 있기 때문에 needle을 이용한 직접적인 전기융합 방법이 체세포 복제수정란 생산에 효과적이라고 사료된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권2호
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• pp.77-82
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• 2007

This study was conducted to investigate the effects of oocyte maturational age and activation condition on in vitro development of porcine parthenogenetic embryos (parthenotes). Porcine follicular oocytes were matured in vitro for 30 to 44 hr. Maturation rate was examined during in vitro maturation (IVM) every 2 hr interval. The cdc2 kinase activity was measured at 36 and 44 hr of IVM. Some oocytes were activated at 36 or 44 hr of IVM by three different conditions; 1) single electric stimulation (1.5 kV/cm for $30{\mu}sec$; ES), 2) double electric stimulations (1.5 kV/cm for $30{\mu}sec$, followed by 1.0 kV/cm for $50{\mu}sec$ after 1 hr; ES+ES) or 3) ES+ES followed by culture in 6-dimethlyaminopurine (6-DMAP) for 4 hr (ES+ES+D), and cultured for 6-7 days. Maturation rate was significantly increased as culture period was increased to 36 hr (66.9%, p<0.05), and then gradually increased to 87.1% at 44 hr of IVM. The cdc2 kinase activity was decreased (p<0.05) with culture period prolonged from 36 hr to 44 hr. Lower blastocyst formation rate (4.3%, p<0.05) were obtained by ES in 36 hr-matured oocytes compared to other treatments (16.5 and 20.5%) in the same age and the same treatment in 44 hr-matured oocytes (15.0%). High blastocyst formation rate (23.6%) was obtained by ES+ES+D in 44 hr-matured oocytes (p<0.05). These results demonstrate that porcine oocyte activation and in vitro development of parthenotes can be affected by interactions between oocyte maturational age and activation condition.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.77-77
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• 2002

본 연구는 체세포 및 체세포 핵이식란의 염색체 이상에 체세포의 계대의 영향성을 조사하고자 하였다. 한우 성축의 귀 조직으로 얻어진 세포를 공여세포를 체외성숙 후 제핵된 난자에 핵이식을 실시하였으며, 1.9kv/cm, 20$\mu\textrm{s}$/2times의 전기자극으로 융합후 5$\mu\textrm{g}$/ml의 ionomycin에서 4min, 1.9mM 6-DMAP에서 4h동안 배양함으로써 활성화를 유도하였다. 핵이식란은 CRlaa에서 4일간 배양 후 8 -cell단계에서 중기상의 유도를 위하여 상기 배양액 1ml당 0.05$\mu\textrm{g}$ colcemid에서 6-8시간 더 배양하였다. 이후, 6% Fetal bovine serum이 함유된 1% sodium citrate용액에 20분간 저장처리 후, methanol 5 : aceticacid 1 : distilled water 4로 1차, methanol 3: aceticacid 1 로 조성된 2차, methanol 4 : acetic acid 3 : distilled water 1의 3차고정액으로 1분간 재 침지시켰다. 고정 처리가 완료된 slide는 4% Giemsa용액으로 염색한 후 광학현미경 하에서 핵형 양상을 검경하였다. 체세포의 5계대에서는 684개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 72%가 정상으로 60개이었고, 24%가 60개 이하였으며 4%가 60개 이상을 보였다. 10계대도 5계대와 비슷하여 71%가 정상, 26%가 60개 이하, 3%가 60개 이상이었고, 15계대에서는 55%가 정상이었고, 30%가 60개이하, 15%가 60개 이상을 보였다. 10계대 까지는 mixoploid의 비율의 변화가 없었으나 15계대에서 현저하게 늘어남을 볼 수 있었다. 또한 체외수정란과 핵이식란의 비교에서는 체외수정란은 250개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 95.6%가 정상으로 60개이었고, 2.0%가 60개 이하, 2.4%가 60개 이상이었으나, 핵이식란은 204개를 검경하여 88%가 정상이었고, 4.9%가 60개이하, 7.1%가 60개 이상을 보임으로써, 핵이식란이 체외수정란에 비하여 염색체 이상의 비율이 높았다. 따라서 계대에 따라 체세포의 염색체이상의 비율이 상대적으로 증가하고, 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상이 생길 수 있음을 알 수 있었다. (이 논문은 농림부 연구비에 의해 수행되었음)

• 한국수정란이식학회지
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• 제31권2호
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• pp.131-136
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• 2016

Since the first success of animal cloning, somatic cell nuclear transfer presented various ideas in many research areas such as regenerative medicine. However, SCNT embryos has poor survival rate. Therefore, numerous researches carried out to enhance the developmental capability of porcine nuclear transfer embryos. Cytochalasin B, demecolcine, latrunculin A, cycloheximide and 6-dimethylaminopurine are efficient chemicals treated in post-activation procedure to increase the efficiency of SCNT. This review study is aim to investigate the effects of these chemicals applied to post-activation in porcine SCNT. Cytochalasin B, demecolcine, latrunculin A are cytoskeletal manuplators inhibit extrusion of pseudo-polar body. Cytochalasin B and demecolcine showed considerably higher blastocyst formation proportion (26-28%) compared to when they are not treated (16%). And when latrunculin A was treated for postactivation, blastocyst formation proportion was increased in SCNT embryos exposed to LA (38%) than those in control (14%). On the other hand, cycloheximide and 6-dimethylaminopurine are protein synthesis and kinase inhibitors. And they help to maintain $Ca^{2+}$ fluctuation in oocytes. Cleavage and blastocyst rates of NT embryos were increased when they were exposed to CHX (16.9% and 5.4% with no CHX).And 6-DMAP also showed higher blastocyst formation (21.5% compared to 15.7%, control). Although all these chemicals have different mechanisms, they showed developmental competence enhancement in NT embryos. However, there are only few studies comparing each chemical's post-activation effect. Therefore, further research and study should be conducted to find optimal chemical for improving the efficiency of SCNT.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.87-87
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• 2003

난자성숙 중 MPF활성은 MI 과 MII에서 최대로, MII로의 성숙 직후 난자를 핵이식에 이용하는 것은 핵과 세포질 사이의 reprogramming에의 효율을 높일 수 있을 것이다. 일반적으로 돼지의 IVF나 핵이식은 체외성숙후 44h에 이뤄지고 있다. 이는 aging을 낳을 수 있고 aging은 또한 발달능을 떨어뜨릴 수 있다. 따라서, 본 실험은 돼지의 체외성숙시간에 따른 체외성숙율과 단위발생후 체외발달율을 비교하여 최적의 체외성숙시간을 찾고자 실시하였다. 돼지 난포란을 10% pFF, 0.1mg/ml cysteine, 10IU/ml PMSG, 10IU/ml hCG, 10ng/ml EGF가 첨가된 TCM-199배양액에서 22, 30, 44시간 동안 배양하여 성숙을 유도하였다. 체외성숙이 야기된 난자는 난구세포를 제거한 후 전기자극(2.0kv/cm, $30 \mu s$) 후 5분 동안 TCM-199에서 세정하고 다시 4시간 동안 6-DMAP에서 배양된 후 4mg/ml BSA가 첨가된 NCSU-23에 넣어 $39^{\circ}C$, 5% $CO_2$배양기에서 각각 6-7일 동안 배양을 실시하였다. 체외성숙 22시간 성숙난자는 M I 44.3%(35/79)와 A I -T I 36.7%(29/79)로 81%가 M II로의 성숙에는 아직 미치지 못했다. 30시간 성숙난자는 46.3%(56/121)가 M II로 성숙하였고, M I과 A I -T I 은 각각 25.6%(31/121), 27 3%(33/121)이었다. 44시간 성숙난자는 78%(71/91)가 M II로 성숙하였고, M I 과 A I -T I 은 각각 12.1%(31/121), 7 7%(33/121)이었다. 단위발생율은 22시간에 난할율은 35.4%(75/137)이었고, 배반포 발달은 없었다. 30시간에 난할율은 51.8%(145/280)이었고, 배반포 발달율은 5.5%(8/145)이었다. 44시간에 난할율은 80.0%(244/306)이었고, 배반포 발달율은 14.3%(35/144)이었다. 본 연구결과 핵 및 세포질의 완전한 성숙은 44h에 이루어지고, 이에 따른 배발달율도 뒤따름을 알 수 있었다. 난자가 핵성숙의 완성에도 불구하고 완전한 활성을 위한 발달능은 갖지 못함을 알 수 있었으며, 질 좋은 배반포 생산을 위해 핵과 세포질 성숙의 synchronous가 중요하다 사료된다. 체외성숙을 위한 배양기술의 진전과 더불어 체외성숙 시간에 따른 세포질적인 기전에 대한 연구가 필요하다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.91-91
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• 2003

항생제는 일반적으로 포유동물 난자의 체외 성숙배지나 배양배지에 첨가된다. 그러나 이들 항생제들이 포유동물의 체외 난자성숙에 미치는 영향들은 아직 완전히 검토되지 않고 있다. 본 연구에서는 염소 난포란에서 체외성숙 능력과 그 후의 단위생식 활성화에 penicillin, streptomycin 또는 gentamycin이 영향을 미치는지에 대하여 조사하였다. 도축장으로부터 수집된 난소로부터 난자-난구세포 복합체들을 회수하여 5개의 처리구 [1) Control: TCM-199 medium with no antibiotics, 2) TCM-199 with 100 IU/ml penicillin, 3) TCM-199 with 50 ug/ml streptomycin, 4) TCM-199 with 50 ug/ml gentamycin, 5) TCM-199 with both 100 IU/ml penicillin and 50 ug/ml streptomycin]에서 24시간 동안 성숙시켰다. 그리고 성숙된 난자들은 ionomycin 처리에 의한 단위생식 활성화를 시킨 후 6-diethlaminopurine(6-DMAP)에서 노출시킨 다음 5개의 항생제 처리구에서 48시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 체외성숙이 유기된 난자에서 제 1 극체가 뚜렷이 방출된 것을 관찰하여 성숙율은 얻었고, 단위생식 활성화는 48시간 후 4-cell 단계의 난분할 관찰에 의해 평가하였다. 24시간 동안 체외성숙이 유기된 미성숙 염소 난자의 성숙비율은 69.1~73.8%로 나타났으나 Streptomycin 처리구에서는 42.5~45.7%로 나타나 유의적인 차이가 인정되었다. (p<0.01) 그러나 48시간 후의 성숙난자의 난할비율에서 5개의 처리구들 사이에는 유의적인 차이가 없었다. penicillin과 gentamicin 처리 집단들은 성숙비율과 48 시간 후 4-cell 단계로의 난분할 비율에 크게 영향을 미치지는 않았다. 그러므로 streptomycin은 미성숙 염소 난자의 체외성숙을 억제하지만 성숙된 난자에서 다음 단계로의 배발달에는 영향을 주지 않는 것이 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권2호
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• pp.89-95
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• 2007

본 연구는 재래 산양의 체세포 핵이식에 의하여 생산한 복제 산양(진순이)의 조직으로부터 공여 핵을 배양하여 다시 핵이식을 실시하여 재복제에 따른 융합율과 분할율, 이식 후의 수태율 등을 조사하여 재복제 가능성 여부를 검토하기 위하여 실시하였다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하여 핵이식을 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화 처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외 배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 발정일로 부터 제 30일과 60일째에 초음파 임신 진단기로 임신 진단을 실시하고, Progesterone농도는 이식 후 21일째와 63일째의 혈액을 채취하여 RIA 방법으로 검사하였다. 체세포 핵이식에 의한 재복제란(2nd)을 전기 자극에 의한 융합을 1회 실시하였을 때 융합율은 65.9%로서 복재란(1st)의융합을 51.0%보다 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 2회 전기자극을 실시하였을 때는 각각 77.4 및 63.9%로서 차이가 없었으나, 3회 재복제란 융합율도 87.5%로서 복제란의 70.1%와 유의적인 차이는 없었다. 재복제 융합란의 분할율은 56.0%로j 복제 융합란의 77.7%보다 낮았다. 재복제란을 수란 산양에 이식을 실시하여 임신 제21일과 63일째 임신 진단을 실시하였을 때 수태율을 수란 산양의 발정유기 방법에 따른 수태율에 있어서 재복제란의 21일째 수태율은 39.3%로서 복제란의 17.4%보다 높았으며, 63일째는 각각 14.3 및 13.0%로서 복제 회수에 따른 수태율의 차이는 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 있어서 제 21일째에 자연발정이 발현된 수란 산양의 수태율은 45.4%로서 인위적으로 발정 동기화를 유도한 수란 산양의 35.3%보다 높았다. 제 63일째는 각각 18.2 및 11.8%로서 차이가 없었다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이식에 의한 복제효율에 있어서는 복재와 재복제간에 차이가 없었으며, 수란산양의 발정 동기화 방법에 따른 수태율에 있어서도 차이가 없었다. 그러나 앞으로 재래 산양의 복제 효율 개선을 위해서는 양질 난자의 다량 확보, 산양 수정란의 체외 배양 체계 확립, 이식 기법의 개발 등에 관한 후속 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.60-60
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• 2001

Human thrombopoietin (hTPO) is a cytokine that plays a central role in megakaryopoiesis by influencing on the development and maturation of megakaryocyte and platelet production. To induce hTPO production in the mammary gland, expression vector was constructed by combining the promoter of bovine beta-casein gene, cDNA of hTPO and neomycine resistance gene for transfection into fibroblasts. Bovine fibroblast cells derived from female ear skin were transfercted with the expression vector using Lipofectamine (Life Technology, NY). Transected cells resistant to G4l8 treatment (600 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$) were recovered and colony formation was initiated at 13 days. The colonies with about 1 cm diameter were picked and analysed by PCR. Single transfected cells were individually transferred to enucleated oocytes. After electrofusion, the reconstructed embryos were exposed to calcium ionophore (5uM) for 5 min followed by treatment with 6-DMAP (2.5 mM) for 4h. The nuclear transfer embryos were cultured in CRlaa medium at 38.5C, 5% $CO_2$ for 7 days. Twenty three of 29 (79.3%) colonies were proved to be hTPO transfectants by PCR. The colonies were further passaged and used to produce transgenic embryos using nuclear transfer. Cleavage and developmental rates of reconstructed embryos to the blastocyst stage were 65.1% and 39.4%, respectively Of 22 blastocysts that developed from reconstructed embryos with the transfected cell, 20 embryos (90.9%) were positive for hTPO by using PCR analysis. The results suggest that somatic cell nuclear transfer is efficient for production of transgenic embryos.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제29권3호
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• pp.175-180
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• 2005

본 연구는 demecolcine 처리에 의한 탈핵과 수핵란 세포질의 세포 주기가 소 체세포 핵이식란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 체외에서 $16\~20$시간 성숙배양된 난자를 극체 방출 유무 및 MI, MII기 난자로 구분하여 $0.4\;\muL/mL$ demecolcine으로 40분간 처리 후 염색체 부위가 돌출된 난자는 탈핵 후 핵이식에 공시하였다. 소의 귀 피부 세포를 탈핵란에 이식하여 전기융합과 활성화 처리(Ca-ionophore+DMAP)를 거쳐 체외 배양하였다. Demecolcine처리 후 $86.2\%$의 난자가 염색체 부위의 돌출을 보여 이 중 $98.8\%$가 탈핵에 성공하였다. Demecolcine은 핵이식란의 발육에 영향을 주지 않았다. 제1극체 방출란 유래 핵이식란의 배반포 발육율은 극체 미방출란 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 높았다($18.2\%\;vs.\;4.6\%\cdot$, P<0.05). 한편, MI 난자 유래 핵이식란의 분할율 및 배반포 발육율은($69.4\%$와 $5.9\%$) MII 난자 유래 핵이식란에 비하여 유의적으로 낮았다($96.7\%$와 $23.9\%$, P<0.05). 본 연구의 결과는 demecolcine 처리가 소 난자의 탈핵에 매우 효과적이며 MII기 난자가 MI기 난자에 비하여 수핵란 세포질로 더 적절하나 극체 미방출란 및 MI기 난자도 비록 제한적이기는 하지만 핵이식란의 배반포 발육을 지원할 수 있음을 보여준다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.137-146
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• 2006

본 연구는 공여 세포의 종류, 수핵 난자의 유래 및 수란 산양 발정 동기화 조건이 복제 산양 생산에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하였으며, 배란이 되지 않은 난포란은 난포로부터 흡입 채취한 후, 22시간 동안 체외 성숙을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 zona drilling 후, 극체와 세포질 일부분 제거를 통해 제핵을 실시하고, 핵이 제거된 난자의 위란강 내로 공핵 세포를 도입하여 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 초음파 임신 진단기로 이식 후 제 30일과 60일에 실시하였다. 귀세포를 공핵 세포로 사용하였을 때 융합율이(63.8 VS. 26.5%) 태아 세포를 사용했을 때보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 총 102개의 복제 수정란을 20두에 이식하였으며, 30일에 4두(20.0%)가 임신하였으며 이중 1두가 1두의 복제 산양을 생산하였다. 수란 산양과 공란 산양간의 발정 동기화 간격(${\pm}0$ 또는 +12시간)별 수태율은 각각 18.2 및 16.7%로서 유의적인 차이가 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 따른 수태율에 있어서 CIDR 제거 후 hCG 및 PMSG를 투여하였을 때는 25%가 수태하였으나, hCG만 투여한 수란 산양은 수태가 되지 않아 인위적으로 발정 동기화된 수란 산양을 이용하였을 때는 산자를 생산하지 못했다. 자연 발정 산양의 경우, 발정이 동기화된(${\pm}0$) 수란 산양 1두에 체내 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산한 5 개의 복제 수정란을 이식하여 149일만에 국내에서 처음으로 복제 산양(진순이) 생산에 성공하였다. 체외 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산된 복제 수정란 5개를 이식하였으나 수태가 이루어지지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이 식에 의한 복제 산자 생산에서 보다 효율성을 높이고 수태율을 향상시키기 위한 조건은 체내 성숙 난자를 수핵 난자로 이용하여 공란 산양과 발정이 동기화된(${\pm}0$) 자연 발정 수란 산양에 복제 수정란을 이식하는 것이 바람직한 것으로 생각된다.