Candida sp. L-16 균주가 생산하는 D-xylulokinase는 배양균체를 초음파 파쇄한 조효소액으로 하여 황산암모늄 염석, DEAE-cellulose, chromatography, Sephadex G-100과 Sephadex G-200 gel filtration 과정으로 정제하여 최종 수율 11.2%로 약 23.2배 정제하였다. 정제 효소의 분자량은 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량은 75,000 dalton으로, Sephadex G-200겔 여과에 의해 150,000 dalton으로 나타나 dimer로 확인되었다. 효소 활성에 미치는 최적 반응 온도는 4$0^{\circ}C$로 나타났고, 온도안정성은 비교적 불안정하여 3$0^{\circ}C$이상에서는 빠르게 실활되었다. 정제 효소의 최적 반응 pH는 pH 8.0이었고, pH 7.0에서 pH 9.0 사이에서 비교적 효소활성이 높았다. 본 효소는 D-xylulose, D-arabinose, D-ribose등에서는 높은 기질특이성을 가지고 있었으나 D-xylose, D-glucose, L-arabinose 등은 기질로서 작용하지 못하였다. 정제 효소의 활성화 에너지값(Ea)은 $25^{\circ}C$ 내지 4$0^{\circ}C$$^{\circ}C$의 온도 범위에서 4.75kcal/mol이었다. 효소의 활성화제로는 EDTA, cysteine-HCl, DTT, glutathione 등이 존재하며 억제제로는 6-phosphogluconic acid, 2-koeto-gluconic acid 등으로 나타났다.
전보에서 보고한 Bradyrhizobium japonicum 9 균주와 Rhizobium fredii 7 균주의 균체 중의 단백질 Pattern의 차이를 일차원 및 이차원 전기영동법에 의하여 조사하였다. 일차원 전기영동법 (SDS-PAGE)에 의해서는 두 group의 균체에서 모두 52개의 band가 관찰되었고 그 중 6개의 main band 로써 group 간의 차이가 확인되었으며, 이차원 전기영동법(2D-PAGE)에 의한 두 group간에 단백질 구성은 Rhizobium fredii 에서는 단백질이 산성 쪽에, Bradyrhizobium japonicum 는 alkali성 쪽에 비교적 많이 분포되어 있었다. 또한 두 group 간의 균체 아미노산 조성을 조사한 결과 조선상의 뚜렷한 차이가 없었다. 분리된 근류균을 확인하는데 전기영동법이 유용하였으며, 일차원 전기영동법은 많은 균주를 신속하게 확인할 수 있었고 이차원 전기영동법은 해상력 및 분리된 단백질 spot를 분석하는데 용이하였다.
This study was performed to develop thin layer drying equations fur short grain rough rice using far-infrared ray. Thin layer drying tests was conducted at four far-infrared ray temperature levels of 30, 40, 50, 60$^{\circ}C$ and two initial moisture content levels of 20.7, 26.2%(w.b.). The measured moisture ratios were fitted to Lewis and Page drying models by stepwise multiple regression analysis. Half response time of drying was affected by both drying temperature and initial moisture content at drying temperature of below 40$^{\circ}C$, but at above 40$^{\circ}C$ was mainly affected by drying temperature. Experimental constant(k) in Lewis model was a function of drying temperature, but K and N in Page model were function of drying temperature and initial moisture content. Moisture ratios predicted by two drying models agreed well with experimental values. But in the actual range of drying temperature above 30$^{\circ}C$ Page model was more suitable for predicting of drying rates.
3종의 빙핵세균 Peudomonas syringae 8401, Pseudomonas fuorescens 8701, Erwinia herbicola 8701의 세포 외막으로부터 아무런 변성제도 사용치 않고 sucrose density gradient centrifugation, Sephacryl gel filtration chromatography, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, non-denaturing buffer를 이용한 PAGE, electroelution, SDS-PAGE를 통해 빙핵활성 단백질을 고도로 정제할 수 있었다. P. suringae와 P. fluorescens에서는 각각 3종류(155 kD, 75 kD, 50 kD)의 빙핵활성 단백질이, E. herbicola에서는 155 kD를 제외한 2종류(75 kD, 50 kD)의 빙핵활성 단백질은 이 연구를 통해 처음 밝혀진 것으로 , 지금까지 보고된 빙핵활성 단백질(150 KD 이상)보다는 훨씬 작은 것이다. 이는 빙핵활성을 나타내는 단백질의 기본단위는 이 실험의 결과만에 의하면 최대 50 kD임을 시사한다. 이들 단백질은 그 유래된 세균의 종류나 또는 단백질 분자량의 크기에 관계없이 모두 -5.5~7.5$^{\circ}C$에서 물을 동결시키는 높은 빙핵활성을 갖고 있었다. 이는 지금까지 보고된 어느 정제단백질의 빙핵활성보다 높은 것이다. 정제된 단백질의 빙핵활성은 trypsin 처리에 의해 상실되었고, pH6~8범위에서는 안정하였으며, pH5이하, pH9이상에서는 활성을 상실하였다. 보존온도에 대한 영향은 3$0^{\circ}C$이상이 되면 점차 활성이 감소하는 경향을 보이다 37$^{\circ}C$이상에서는 활성이 완전히 상실되었다. 금속이온으로서 Hg\ulcorner이온과 SDS에 의해 활성이 상실되었으나 phosphatidylinositol의 첨가에 의해서는 활성이 약간 증가(-1$^{\circ}C$)하였다.
아스코크로린(Ascochlorin, ASC)은 Ascochyta viciae로부터 추출된 프레닐페놀 물질로, 혈청 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수치를 감소시키고 종양 성장을 억제한다는 연구 결과가 보고되어 있다. 본 논문에서는 아스코크로린이 생리학적 혹은 병리학적인 작용과 염증반응에서 약리학적으로 유도되는 반응을 어떻게 조절하며, 이러한 메커니즘에 대해 이해하기 위해 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린을 처리하여 이에 대한 프로테옴의 특이적인 발현에 대해 분석하였다. 따라서 본 연구는 LPS를 처리한 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린을 처리하여 염증과정에 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 프로테오믹스를 시행하였다. Mouse macrophage RAW264.7 세포에 아스코크로린을 처리한 조건과 무처리한 조건으로 나누어 two-dimensional electrophoresis (2-D SDS-PAGE), matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF-MS)와 bioinformatics 방법으로 아스코크로린을 처리한 mouse macrophage Raw264.6 세포의 프로테옴을 분석하였다. 그 결과 mouse macrophage Raw264.7 세포에 아스코크로린 처리 시 Calreticulin이 4배 감소, ${\beta}-actin$도 4배 감소 그리고 vimentin이 1.5배 감소함을 확인 할 수 있었다. 그러나 rabaptin 아스코크로린 처리에 의해 3배 증가함을 확인 할 수 있었다. 이러한 단백질 발현은 RT-PCR을 수행하여 결과에 대해 재확인 하였으며, 프로테오믹스와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 LPS 처리에 의해 활성화된 mouse macrophage RAW264.7 세포에 ASC를 처리한 후 이차원 전기영동법을 이용하여, 단백질의 발현 변화 및 양상을 규명하고 단백질 지도를 확립 하였으며, RAW264.7 세포를 이용한 면역세포 모델에서 ASC의 항염증 작용을 중심으로 생리활성 조절기능을 확인 할 수 있었다. 향후 분자 기능 조절 연구와 전 임상 연구를 통해 ASC의 생리활성 조절 기능을 규명한다면 ASC는 항염증 및 항암활성을 갖는 약물로 개발될 것으로 기대된다.
In order to study the reaction behavior of bovine holo- and apo-$\alpha$-lactalbumin ($\alpha$-La) during heat treatment at 65~10$0^{\circ}C$, the samples were analysed by first (ID)-and second-dimensional (2D) native-polyacrylamide gel electrophoresis (Native-PAGE) and sodium dodecylsulfate (SDS)-PAGE. When bolo-$\alpha$-La or apo- $\alpha$ -La were heated, they formed non-native, monomers, dimers and trimers. The apo-$\alpha$-La was more heat-sensitive than holo-$\alpha$-La. The monomers seemed to have the same composition as the native $\alpha$-La, but many of the disulfide bonds could be non-native.
A novel calcium binding protein (CaBP) was purified to electrophoretic homogeneity from Dunaliella salina. In the course of purification experiment, this CaBP was identified as a monomer and its molecular weight was about 21 kDand isoelectric point (pI) value was about 4.1 using isoelectrofocusing. This CaBP was able to bind Ca2+ even in the pressence of an excess MgCl2 and KCI both in solution. In the SDS-PAGE, the Ca2+-bound form was slower than the Ca2+-free form in the nondenaturing PAGE. This means that the CaBP undergoes conformational change in the Ca2+-bound condition. Furthermore, UV absorption spectrum and fluorescence intensity of this CaBP was investigated. UV absorption peak was appeared at about 258 nm and decreased somewhat in Ca2+-bound condition. In the measurement of fluorescence, maximum intensity was appeared at 303 nm and decreased in Ca2+-bound state, similarly as UV absorption spectrum. These show distinct changes upon Ca2+-binding, which indicate of structural and/or dynamic changes largely reminiscent of other members of the EF-hand Ca2+-binding protein family.
겨우살이가 가지고 있는 lectin의 약리작용의 가능성에 대한 연구의 일환으로, lectin을 분리 . 정제하였으며, 분자량, subunit수, 탄수화물의 조성, 단백질의 아미노산 조성, 적혈구 응집력, 탄수화물 특이성, pH 및 열 안정성등의 생화학적 특성을 연구하였다. Lectin의 분리는 0.15 M NaCl에 의한 추출, $(NH_4)_2SO_4$ 침전, sepharose 4B affinity chromatography 및 sephadex G-150 gel filtration에 의해 11.64배 정제에 0.14%의 수율을 획득하였으며, HPLC와 전기영동을 이용하여 순도를 검정하였다. Gel filtration에 의해 분석된 lectin의 분자량은 124,000 Da이였고, SDS-PAGE에 의해 분자량이 30,000과 32,000 Da인 2개의 band로 나타나서 각각 2개의 subunit를 갖는 tetramer로 확인되었다. 겨우살이 lectin의 탄수화물은 glucose, fructose, arabinose 및 xylose를 함유하고 있다. 또한 phenlylalanine, lysine, tyrosine, aspartic acid가 비교적 풍부하였고 methionine, alanine, arginine은 비교적 적었다. Lectin은 적혈구에 종 특이성을 나타내는데 겨우살이의 혈구응집반응에서는 사람혈액형간의 차이는 없었으며, 쥐에서 가장 높았고 소에서 가장 낮았으므로 동물 종간에 대한 특이성은 뚜렸하였다. Lectin은 당 특이성을 가지는데, D-galactose, D-mannose, D-lactose 및 D-raffinose에 대해 특이성을 나타내었다. 겨우살이 lectin은 pH4~7에서 안정하였으며, 5$0^{\circ}C$까지는 10~30분 열처리해도 활성이 유지되는 열 안정성 단백질이었다.
Bacteria have been regarded as a one of major etiologic factors in root canal infections. In endodontic treatment the effective removal of pathogenic microorganisms in the root canal is the key to successful outcome. Bacterial cell wall components may play an important role in the development of pulpal and periapical disease. The purpose of this study was to evaluate the effect of sonic extracts of Streptococcus spp. on cultured L929 cells and to characterize cell wall protein profiles of Streptococcus spp. Streptococcus spp. were isolated from infected root canals and identified with Vitek Systems(Biomeriux, USA). Five streptococci, namely S. sanguis, S. mitis, S uberis, S. mutans (ATCC 10449) and S. faecalis (ATCC 19433) weere enriched in brain heart infusion broth. Cell pellets were sonicated and cell wall extracts were dialyzed and membrane filtered. Prepared cell wall proteins were applied to cultured L929 cell. The cell reaction were evaluated by monitoring DNA synthesis, cell numbers and the change of cell morphology. The total cell wall protein profiles of microorganisms were characterized by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide-gel eledruphoresis(SDS-PAGE). DNA synthesis of L929 cells were reduced by the increasing concentration of sonic extracts. DNA synthesis was significantly suppressed in more than $50{\mu}g$/ml of sonic extract conentration in five streptococci. S. nutans (ATCC 10449) showed stronger suppression on DNA synthesis than remaining four streptococci, which had the similar effect on DNA synthesis. Analysis of DNA synthesis measured by [$^3H$]-thymidine uptake was more sensitvie method than cell counting. Sonic extracts affected the microscopic findings of L929 cells. The protein profiles indicated that all five strains shared two major proteins with molecular masses of 70.8 and 57.5 kD respectively. S. uberis and S. mutans shared common minor proteins of which molecular weights were 147.9 and 112.2 kD respectively. However some minor proteins were unique for S. mitis, S. uberis and S. faecalis.
An exoinulinase (${\beta}-D-fructofuranosidase$) gene was cloned by chromosome walking along the upstream region of the endoinulinase gene of Pseudomonas mucidolens isolated from soil. the exoinulinase gene consisted of an ORF of 0,506 bp encoding a polypeptide of 501 amino acids with a deduced molecular weight of 55,000. The exoinulinase produced by the recombinant Escherichia coli $DH5{\alpha}$ strain was also purified to homogeneity as determined by SDS-PAGE and a zymogram. The molecular weight of the purified exoinulinase according to both SDS-PAGE and gel filtration matched the deduced molecular weight of the protein described above, thereby indicating that the native form of the exoinulinase was a monomer. The purified enzyme hydrolyzed activity value of 2.0. Furthermore, no inulo-oligomers were liberated from the inulin substrate in the enzymatic reaction mixtures incubated for 90 min at $55^{\circ}C$. Taken together, these results indicate that the purified ${\beta}-D-fructofuranosidase$ was an exoinulinase. The pH and temperature optima of the exoinulinase were pH 6.0 and $55^{\circ}C$, respectively. the enzymehad no apparent requirement for a cofactor, and its activity was completely inactivated by $Ag^{+},{\;}Hg^{2+},{\;}and{\;}Zn^{2+}$. Kinetic experiments gave $K_m,{\;}V_{max},{\;}and{\;}K_{cat}$ values for inulin of 11.5 mM, 18 nM/s, and $72{\;}s^{-1}$, respectively. the exoinulinase was fairly stable in broad pH conditions (pH 5-9), and at pH 6.0 it showed a residual activity of about 70% after 4 h incubation at $55^{\circ}C$.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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