• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.153-163
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• 2002

본 연구에서는 레트로 바이러스를 이용하여 형질전환 돼지를 생산하기 위한 기초 연구로써 유전자 도입 효율을 증진시키기 위해 sucrose와 poly-brene을 사용하여 그 효과를 조사하였다. 유전자(hGH) 전달체로는 vesicular stomatitis virus gly-coprotein pseudotyped retroviral vector (VSV-G)를 사용하였다. 체외에서 성숙된 돼지 난자는 매우 협소한 위란강내 공간을 가지며 따라서 위란강내 공간의 확장은 필수조건이다. sucrose 처리는 수정율및 배발달에는 영향을 미치지 않았으며 sucrose 처리를 통해 돼지난자는 위란강의 공간이 확장되어 충분한 양의 바이러스 벡터의 주입이 가능하였다. PCR 분석 결과 8.3 %의 유전자 도입율을 나타낸 무처리군에 비해 0.5, 1, 2, 3 % sucrose 처리군에서 39.3, 43.3, 35.7, 40.7 %의 높은 유전자 도입율을 나타내었다. 추가적으로 돼지난자는 sucrose 처리에 의해 다정자 침입의 억제 효과를 나타내었다. 일반적으로 레트로 바이러스를 이용한 세포에의 높은 유전자 도입 효과를 나타내는 것으로 알려진 polybrene을 바이러스와 공동 주입한 결과 0.5, 5, 50$\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 농도에서 각각 56.5, 50.0, 57.1 %의 도입율을 나타냄으로써 바이러스 단독 주입군의 34.6%보다 높은 효율을 나타내었다. 그러나 50$\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 농도를 주입하였을 경우, 분할율과 배반포발달율이 43.3 및 4.6%를 나타냄으로써 바이러스 단독주입군의 72.0, 17.3%보다 유의적으로 낮았다. 이상의 결과를 종합할 때, sucrose의 처리는 돼지 난자의 발달에 영향을 주지 않으며 유전자 도입효율을 증진시킬 수 있었으며, 추가적으로 다정자 침입억제효과를 보였다. 또한 polybrene의 사용은 낮은 농도에서 유전자 도입효율을 증진시켰다. 이러한 결과들은 형질 전환 돼지의 생산 가능성을 높이는데 이용될 수 있다고 사료된다.

• 한국식품영양학회지
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• 제17권1호
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• pp.47-52
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• 2004

Mammaglobin은 uteroglobin 유전자와 상동성을 가지는 분비 단백질로 인체 유방암 조직에서 과발현된다. 이 단백질은 유방암의 진단, 전이 정도의 진단, 또는 수술 및 항암치료 후 재발 정도의 검색을 위한 하나의 표식자로 가능성을 갖는다. 본 연구는 mammaglobin 유전자를 클로닝하여, 대장균으로부터 발현하고, 발현된 mammaglobin 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 이용하여 항체를 생산하고, 분리된 항체가 mammaglobin에 대한 특이 반응을 갖는지를 확인하였다. 유방암 환자의 조직을 얻은 후 이 조직에서 RNA를 분리한다. 이 RNA로부터 RT-PCR법으로 mammaglobin 유전자를 클로닝하였다. 증폭된 유전자를 NcoI 과 XhoI으로 절단한 후 벡터에 끼워 넣은 후 대장균에 형질 전환시키고 DNA 염기 서열을 결정하였고, 기존의 mammaglobin 유전자의 염기서열과 비교한 결과 동일한 유전자임을 확인하였다. Mammaglobin의 세포 내 발현, 신호 펩타이드를 이용한 분비발현을 위해 pET30, pET20, pET32 벡터를 각각 이용하였다. 3개의 발현시스템으로부터 단백질이 과 발현됨을 확인할 수 있었다. pET30 벡터를 이용하여 성공적으로 발현된 mammaglobin 단백질을 분리할 수 있었다. Ni-NTA affinity chromatography에 이은 DEAE-ion exchange chromatography 분리 방법에 의해 수용성 발현 단백질인 thioredoxin-mammaglobin을 정제할 수 있었고 이 융합 단백질로부터 enterokinase를 이용하여 mammaglobin 단백질만을 분리하였다. 토끼에 분리된 mammaglobin을 complete adjuvant와 혼합하여 면역한 후 두 번 boosting하여 polyconal 항체를 얻었다. Westernblot immuno 분석을 한 결과 생산된 항체가 mammaglobin 단백질과 특이적 항원항체반응을 보임을 관찰하였다. 향후 이 항체를 이용하여 진단용 시약의 개발이나 항암제 개발 등을 위해 연구가 진행될 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제43권4호
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• pp.450-456
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• 2016

한국형 잔디에서는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후 구제하기 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2 (IV)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 ${\beta}-1,3-glucanase$를 들잔디로부터 클로닝 하였다. ${\beta}-1,3-glucanase$는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포 외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 병원균 저항성기능을 하는 것으로 알려져 있다. ${\beta}-1,3-glucanase$ 단자엽식물 중 내병성에 대한 연구가 되어있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 클로닝 하였다. E.coli overexpression을 수행하여 목표 단백질을 대량 정제하여 in vitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1 유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R. cerealis, F. culmorum, R.solani AG-1 (1B), T. atroviride 에서 항균활성을 보였으며, 형질전환체를 이용해 18s 유전자의 발현량을 상대로 한 각 유전자의 기관별 발현량은 크게 차이없이 모든기관에 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제53권1호
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• pp.1-7
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• 2010

xylA 프로모터는 대장균의 xylose 대사에 관여하는 xylose 오페론 상의 중요한 프로모터이다. 이 프로모터는 xylose에 의해 강하게 조절을 받는다고 알려져 있다. 이러한 특징은 새로운 발현 백터를 구축하는데 충분한 조건을 갖추고 있다고 생각된다. 본 연구에서는 이러한 xylose에 의해 유도 되는 발현벡터를 구축하기 위하여 600 bp의 xylA 프로모터를 증폭하여 pUC18의 AatII와 HindIII 사이에 삽입하여 pXA600을 구축하였다. 또한 조절단백질인 XylR의 영향을 조사하기 위하여 xylR 유전자를 삽입하여 pXAR600을 구축하였다. 발현의 강도를 측정하기 위하여 3,048 bp의 lacZ유전자를 xylA 프로모터의 하류에 연결하여 pXA600-lacZ와 pXAR600-lacZ를 구축하고 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 구축된 pXA600-lacZ와 pXAR600-lacZ는 LB 배지에서 배양하였을 때 xylose 유도하에서 각각 1,641 unit와 2,304 unit의 $\beta$-galactosidase 활성을 보였으며, DM 배지상에서 배양했을 때 xylose 유도 시 각각 6,282 unit와 9,320 unit의 $\beta$-galactosidase 활성을 보였다. 또한 왜래 유전자의 발현 가능성을 확인하기 위하여 S. thermocyaneoviolaceus의 내열성 xylanase를 코딩하는 xynA 유전자를 실제로 구축된 pXA600과 pXAR600에서 발현을 확인하여 pXA600 및 pXAR600이 새로운 xylose 유도성 발현벡터로서의 사용 가능성을 확인하였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.443-448
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• 1996

xylA 유전자의 프로모터상에서 조절양상을 조사하기 위하여 xylA 유전자의 프로모터(Pxyl)와 lacZ 유전자를 연결한 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 제작하여 xylose에 의한 ${\beta}-galactosidase$ 생산의 조절양식을 조사하였다. xylA 프로모터 부위를 분리하여 lac 프로모터가 없는 고복제수의 lac 오페론 백터인 pMC1403에 클로닝시켜 pMCX191을 제작하여 reading frame에 변화가 없는 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 만들었으며 이 벡터에서 Pxyl-lacZ 단편을 분리한 후 저복제수 벡터인 pLG339에 클로닝시켜 pLGX191을 제작하였다. 상기 플라스미드들을 xylA 변이주인 DH77에 형질전환시켜 Pxyl-lacZ 융합 유전자에서 ${\beta}-galactosidase$의 발현조절을 조사한 결과 xylose 농도에 따른 유도, glucose에 의한 발현억제 및 cAMP에 의한 억제해제 양상 등이 염색체상의xylA 유전자의 발현조절과 같은 경향을 나타내었다. pMCX191과 pLGX191을 이용하여 유전자 투여 량 효과를 본 결과도 복제수에 따른 차이가 크지 않았다. xylA 프로모터 부위내 조절영역를 추정하기 위해 구조유전자 상류 -209 bp를 포함한 xylA 유전자를 pUC19에 클로닝시킨 pUX30에서 프로모터 부위가 부분결손된 벡터들을 제작하여 결손부위의 염기서열을 확인하였다. 이들 부분결손 xylA 프로모터를 가진 xylA 유전자에서 xylose isomerase의 발현을 조사한 결과, 번역 개시점에서 -166 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX31과 pUX32의 경우pUX30과 비슷한 발현 양상을 보인 반면 -120 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX33과 pUX34에서는 모벡터에 비해 약 30% 수준의 발현을 보였다. 또한 pUX33과 pUX34에서는 xylose 유도시 cAMP에 의한 발현 촉진효과도 볼 수 없었다. -59 bp 이상의 부위가 결손된 pUX35의 경우에는 전혀 xylA 유전자의 발현이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 볼때 xylA 프로모터내의 조절부위는 -165 bp에서 -59 bp 사이에 존재하는 것으로 추정되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제46권2호
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• pp.102-110
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• 2018

myo-Inositol (MI)을 대사하여 다른 물질로 전환하는 미생물을 과수원 토양으로부터 분리하였다. 분리균 YB-46은 유일한 탄소원으로 MI이 첨가된 배지에서 성장하였고 16S rDNA 염기서열에 따라 Enterobacter 속의 균주로 추정되었다. Fosmid pCC1FOS 벡터를 사용하여 제조된 거대 유전체 은행으로부터 MI을 미지의 대사 물질로 전환하는 Escherichia coli 형질전환주를 선발하였다. 이로부터 플라스미드를 분리하고 삽입된 유전자의 일부 염기서열을 결정한 결과 336 아미노 잔기로 구성된 myo-inositol dehytrogenase (IolG)를 암호화하는 iolG 유전자가 발견되었다. 분리균 YB-46의 IolG는 E. aerogenes와 Bacillus subtilis의 IolG와 약 50% 수준의 상동성을 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG는 $45^{\circ}C$와 pH 10.5에서 최대 활성을 보였고 MI과 D-glucose에 대한 활성이 가장 높았으며 D-chiro-inositol, D-mannitol 및 D-xylose에도 90% 이상의 활성을 보였다. 최적 반응조건에서 MI을 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 $K_m$과 $V_{max}$가 1.83 mM과 $0.724{\mu}mol/min/mg$로 확인되었다. HtIolG의 활성은 $Zn^{2+}$에 의해 1.7배 증가하였으며, $Co^{2+}$와 SDS에 의해서는 크게 감소하였다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제18권10호
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• pp.551-558
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• 2017

조직특이적 프로모터 및 벡터를 연구하고 검증하기 위해서는 조직 및 종의 특이성을 유지하는 세포 시스템을 개발하는 것이 바람직하다. 이러한 시스템은 형질전환동물 모델에 대한 효과적인 대안이다. 우리는 베타 카제인 (CSN2)의 세포 형태와 mRNA 수준에 기초하여 일차 배양으로부터 돼지 유선 상피 세포 주 (PMECs)를 확립하였다. 선택된 PMECs는 cytokeratin 항체에 의해 염색되었으며, 유선 상피 세포에 존재한다고 생각되어지는 유즙 단백질 유전자 (CSN2, 락토페린 및 유청 단백질)를 발현하는 것으로 나타났다. 또한, 3D 배양에서 PMECs932-7의 acini 구조를 확인하기 위해 살아있는 세포를 핵산에 결합하는 SYTO-13으로 염색하였다. 우리는 마트리겔 (matrigel)에 있는 PMECs의 acini가 말초 세포의 응집에 의해 형성되고 공간의 lumen을 특징으로 한다는 것이 관찰하였다. 우리는 PMECs의 matrigel 사용법과 세포 밀도를 포함한 세포 배양 조건의 영향을 시험함으로서 시스템을 시연했다. 이러한 결과는 PMCEs의 유선 상피 세포는 유전적 또는 구조적 특징을 갖고 있음을 시사하고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.178-182
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• 1989

고온, 호알칼리성 Bacillus K-17 균주에서 한가지 xylanase 유전자를 pBR322를 벡터로 이용하여 클로닝시켰다. Xylan을 함유하는 LB 한천배지에서 분해환을 형성하는 대장균 형질전환주에서 재조합 플라스미드 pAXl13을 분리하였으며, 본 pAXl13 은 pBR322와 고온, 호알칼리성 Bacillus K-17균주 염색체 DNA의 4.3Kb HindIII 절편으로 구성되어 있었다. Biotin으로 표식된 pAXl13을 probe로 하여 상동성시험을 하여 본 결과, pAXl13에 존재하는 4.3Kb Hind III 절편은 고온, 호알칼리성 Bacillus K-17 균주 유래임을 확인하였다. pAXl13 을 가지는 E. coli 균주가 생성하는 xylanase는 균체외에 존재하였으며 그 효소학적 성질은 고온, 호알칼리성 Bacillus K-17 균주의 xylanase I 과 II중에서 xylanase I과 동일하였다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제50권2호
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• pp.122-125
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• 2012

본 연구는 누에 배자 발생 초기 특이 발현 유전자 프로모터를 개발하기 위한 연구의 일환으로 추진하였다. 누에 초기 및 후기 배자로 부터 분리한 mRNA를 사용하여 subtractive hybridization 분석법으로 누에 배자 발생 초기 특이 발현 유전자 4종을 선발할 수 있었다. 선발된 4종 유전자는 각각 BmNanos protein mRNA, BmNanos-P protein mRNA, BmNanos-O protein mRNA 및 BmVasa protein mRNA 유전자와 매우 높은 상동성을 보였다. 또한, 본 연구에서는 Northern hybridization 분석 및 real time PCR 분석을 통하여 배자 초기에 특이적으로 고발현하는 BmNanos-like 등 4개 선발 유전자의 발현 특성을 확인하였다. 이러한 결과는 추후 추진 할 누에 형질전환용 전이벡터의 효율성 제고를 위한 연구에 활용될 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제18권10호
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• pp.1395-1399
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• 2008

우리는 최근에 PRC1 프로모터가 유방암 유전자치료를 위하여 전사 표적이 된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 후보 프로모터임을 보고하였다. 우리는 본 실험에서 PRC1이 폐암유전자 치료에서도 적용이 가능한지 조사하였다. 특정 프로모터가 루시퍼라제 유전자와 연결된 플라스미드를 이용한 형질전환 assay에서 PRC1 프로모터는 정상폐세포주에서는 활성을 보이지 않으나 폐암세포주에선 약 30 배의 활성을 보였다. 이는 이미 암특이적인 발현으로 알려진 BIRC5 (survivin) 프로모터와 유사한 결과였다. 또한, 바이러스 벡터를 이용한 실험에서 PRC1은 CMV 프로모터에 비해 아데노부속바이러스에서 약 75%, 아데노바이러스에서 약 66%의활성을 보였다. 이와 대조적으로, PRC1 프로모터를 함유한 이 들 두 종류의 바이러스는 정상 폐세포에서는 20%정도의 낮은 활성을 보였다. 흥미롭게도, 인간 폐종양세포를 이식한 생쥐모델을 사용한 결과에서는 PRC1 프로모터가 CMV 프로모터와 비슷한 생체 활성을 보였다. 종합하면, 이상의 결과는 PRC1이 폐암 유전자치료를 위한 전사표적 유전자의 발현을 위한 프로모터로 사용 가능함을 암시한다.