인공사료개발연구의 일환으로 상육잠과 인공사료육잠 소화액에 대한 기초자료를 얻기 위해 상엽육잠과 인공사료육단을 공시하고 비교·분석하여 아래와 같은 결론을 얻었다. 1. 적색형광단백질은 50% 포화 acetone 용액에 침전하였고 n-butanol,용액중에 용해되지 않았으며, methanol 용액에는 용해되었다. 2. 상육잠과 인공사료육잠 소화액 acetone분획 전기영동은 이종도가 큰 단백질 band 부분에서 뚜렷한 차이가 있으며 상엽구에서만 첫 번째 band에서 적색형광이 관찰되었다. 3. 경과일수에 따른 상육잠소화액 전기영동상은 5령 1-3일에는 변화가 없으나 5령 4, 5일에 이종도가 큰 band에서 변화가 있었다. 4. 등전점전기영동결과 RFP는 PI 8-9의 염기성단백질이었다. 5. 상육잠소화액 acetone 분획의 SDS 전기영동상에 RFP로 추정되는 band가 나타났고 그 분자량은 27,000이었다. 6. 상육잠과 인공사료육잠소화액의 Sephadex G-75 permeation chromatography 결과 상육구 chromatogram에서는 16번부터 28번 사이에 3개의 흡수대가 있었으며 인공사료구 chromatogram에서는 18번부터 31번 사이에 2개의 흡수대가 있었다.
연구배경 : 결핵치료에서 어려움을 주는 가장 중요한 요인의 하나가 약제 내성균에 감염된 경우이다. 근래 다제내성 결핵균의 증가는 신속한 결핵균 감수성검사방법 개발에 대한 필요성을 더욱 증가시키고 있다. 활발하게 개발이 진행되고 있는 분자생물학적 기법들도 신속한 내성여부의 구분에 많은 도움을 주고 있지만, 아직까지는 검사약제가 제한되어 있고 보완할 점들이 많이 남아있다. 따라서 저자들은 결핵균 세포 염색 방법에 의해 생균과 사균을 구분할 수 있는 신속하고도 정확한 결핵균 약제 감수성 검사 방법을 검토하여 보았다. 방 법 : 본 연구의 대상으로 대표적인 4가지 항결핵 약제(Isoniazid, Rifampicin, Streptomycin, Ethambutol)에 모두 내성인 임상분리 결핵균 20 균주와 모든 약제에 감수성인 임상분리 결핵균 20 균주를 사용하였다. 약제감수성검사시의 최소 희석배수였던 MacFarland #1 탁도로부터 10배 희석한 결핵균액을 7H9 배양액 $30m{\ell}$에 접종한 후 $37^{\circ}C$에서 24시간 배양한 다음, 핵산 염색액인 Syto 9 (MolecularProbes, USA)과 세포질 염색액인 프로피디움(propidium iodide, $C_{27}H_{34}I_2N_4$)을 결핵균과 잘 섞은 후 실온의 암소에서 15 분간 방치한 후 슬라이드에 $5{\mu}{\ell}$씩 점적하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 결 과 : 실험에 사용한 약제내성 결핵균은 4가지의 항결핵약제의 각 농도가 함유된 7H9 배양액에서 사멸하지 않고 생존하고 있음을 형광 현미경상에서 확인 할 수 있었다. 프로피디움(propidium iodide)은 살아있는 세균의 경우 세포핵은 염색시키지 못하고 세포질만 염색함으로써 살아있는 결핵균은 형광현미경 시야에서 녹색을 띄게 되고, 세포의 핵산을 염색시키는 Syto 9 은 사멸한 세포의 세포질을 통과하여 결핵 약제에 감수성인 결핵균의 세포핵을 염색시켜 형광 현미경 시야에서 붉은 색으로 관찰 되었다. 결 론 : Acridin (Syto9)과 propidium 성분을 이용하여 세포를 형광 염색시켜 세포의 사멸 및 생육을 판단하는 방법을 결핵균 약제감수성검사에 적용한 결과, 간편하고도 신속하게 24시간 이내에 내성균과 감수성균을 구분할 수 있었다. 생균과 사균 세포의 판별법으로 기존의 결핵균 감수성 방법을 대체하기 위해서는 형광현미경을 비롯한 실험실 장비와 숙련된 검사자가 필요하지만, 배양된 균으로 검사하는 데만 4주 이상 소요되는 기존의 결핵균 감수성 검사 방법을 대체할 수 있는 매우 저렴하고도 간편한 검사방법으로 판단되었다.
형광 염료와 레이저 겔스캐너 장비를 이용하여 변성아크릴 아마이드 겔에서 전기 영동된 DNA를 신속하고 간편한 방법으로 기존의 은염색법과 비슷한 감도로 검출하고자 하였다. 변성아크릴아마이드 겔을 형광 염료인 SYBR Green (Molecular Probes)이나 Vistra Green (Amersham Bioscience) 0.01 X 희석액 (pH 8)으로 염색한 후 480nm 레이져, 520nm filer 옵션으로 스캔하여 DNA를 검출하였으며, 검출감도는 기존의 은염색법과 비슷하면서 염색 단계를 한 단계로 줄일 수 있었다.
Histamine을 정확하고 신속하게 정량하기 위해 9-Fluorenylmethyl chloroformate를 형광유도체화제로 하여 역상 HPLC법으로 정량하였다. 히스타민을 형광유도체화할 때 반응액의 pH, 반응시간, 형광유도체화제의 농도 등 최적 반응 조건을 검토하였다. 이 방법으로 히스타민을 분석한 결과 $0.1{\sim}0.5{\mu}g/ml$의 농도범위에서 상관계수가 0.992인 양호한 직선성을 나타내였으며 검출한계는 $0.01{\mu}g/ml$였다.
생체시료 중에 함유된 베크로늄브로마이드(VeBr)를 정량하기 위해 로즈벵갈(RB)과 이온쌍착물(ion-pair complex)을 형성시켜 유기용매층으로 이행시킨 다음 형광광도법 및 형광검출기를 이용한 고속액체크로마토그래프(HPLC)법으로 정량하였다. 이 때 이온쌍착물의 최적 추출조건을 검토하기 위하여 완충액의 pH, 추출용매, 진탕시간의 영향을 실험하였다. 한편, 이온착물의 형성 및 조성은 연속변화법, 몰비법, IR, $^1H$-NMR로 확인하였으며, 또한 베크로늄브로마이드와 동시 투여될 수 있는 약물의 영향도 검토하였다.
본 연구에서는 수 환경 내에서 일어나는 주요 자연분획변환 과정 중 생분해 시 변화하는 용존 유기물질의 특성이 중금속 결합특성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 각각 호수와 하천 기원을 대표하는 Pony lake fulvic acid와 Suwannee river fulvic acid를 포함한 다양한 유기물을 대상으로 2주간 배양실험을 하여 변화하는 농도, 성상 및 중금속 구리 결합특성을 조사한 결과 각 시료 내 DOC농도는 감소하고 SUVA 값은 증가하였다. 특히 포도당 및 단백질계 탄소구조 함유비율이 높을수록 미생물에 의한 DOC 농도 분해율은 증가하였다. 포도당과 휴믹물질의 혼합비를 고려한 경우 배양 후 예측되는 혼합액의 DOC 감소율은 실제 측정값과 유사하였다. 그러나 SUVA값은 오히려 더 높게 나타나 생분해성 물질과 휴믹물질이 혼재할 경우 탄소 구조 변화로 인한 휴믹화의 진행이 더 크게 나타날 수 있음을 보였다. Synchronous 형광스펙트럼 결과 배양 후 Pony lake fulvic acid의 경우 휴믹산계 형광특성이, Suwannee river fulvic acid에서는 펄빅산계 형광특성이 크게 증가하였다. 포도당 시료에서는 배양 전 관찰되지 않았던 단백질계와 펄빅산계 형광특성이 관찰되었다. 중금속 구리와의 결합정도를 나타내는 log K 값은 미생물 배양 전과 후 휴믹물질 종류에 따라 변화가 없거나 혹은 약간 감소하는 경향을 나타냈다. 본 실험 결과는 미생물에 의한 휴믹물질 관련 형광구조의 증가가 중금속 결합력 강화에 영향을 미치지 않거나 오히려 감소시키는 것으로 보인다.
본 연구는 식물세포막을 파괴시켜 제초활성을 나타내게 하는 화합물(막과산화형 제초제)을 미지의 많은 화합물로부터 신속하게 탐색하기 위한 새로운 검정법을 확립하기 위하여 실시되었으며, 확립한 전체적인 검정과정은 다음과 같다. 96-well microplate에 시험용액 $200{\mu}L$ 넣고 여기에 오이자엽으로부터 적출한 직경 4 mm의 절편 1개씩을 띄운다. 항온실의 광조건 하에서 회전진탕기로 조금씩 흔들어주면서 8시간 배양한 후 절편을 제거한 다음, 배양액에 HVA와 HRP를 첨가하여 반응시킨 후 마이크로평판용 형광검출기를 이용하여 형광도(Ex 320 nm, Em 425 nm)를 측정한다. 형광변화량이 높을수록 제초활성이 높은 것으로 판단한다. 본 방법은 96-well microplate에서 작업을 수행할 수 있고 형광검출 기술을 이용함으로써 검정과정과 작업을 간편하게 하여 검정효율을 기존보다 현저히 높인 것이 특징이다. 아울러 활성검정을 추출된 효소가 아닌 잎 절편수준에서 수행하기 때문에 보다 실용화에 근접한 정량적 데이터를 얻을 수 있는 장점을 가진다.
본 연구는 인공광을 이용한 순환식 수경재배시 배양액농도가 적축면 상추 생육과 배양액내 다량 원소 농도의 변화에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. 형광등과 LED의 광도는 100μmol m-2·s-1±20 수준이었으며, 배양액 농도는 일본 야채다업시험장 표준배양액의 1/2배액, 1배액 및 2배액 수준이었다. 일주일마다 줄어든 배양액 양만큼 보충하면서 재배되는 수경재배시스템에서 적축면 상추('뚝섬' 동부하이텍, 품종)를 재배하였다. 적축면 상추의 생육은 농도가 진한 2배액에서 가장 좋은 것으로 나타났다. 재배기간 중 배양액의 EC는 1배액에서는 2dS.m-1 내외에서 비교적 안정적으로 유지된 반면 2배액에서는 상승하는 경향을 보였다. 배양액의 무기성분 함량은 2배액, 1배액, 1/2배액 순으로 높았다. 재배기간 중 배양액 내 NO3-N, Ca2+, Mg2+ 농도는 1배액, 2배액에서 지속적으로 증가한 반면, NH4-N 농도는 1배액, 1/2배액에서 지속적으로 감소하는 결과를 나타내었다. 적축면 상추 엽내 K, Ca, Mg 함량은 정상 범위를 유지한 반면, P 함량은 1.3~1.6%로 적정 성분함량 범위 보다 높게 나타났다. 적축면 상추재배 시 재배기간이 경과함에 따라 NH4-N 함량이 감소하는 경향을 보여 NH4-N 비율을 높이거나 더 첨가해 줄 필요가 있는 것으로 나타났다.
본 연구는 돼지에 있어서 정원줄기세포를 포함하는 정소세포를 recipient 돼지의 정소 내로 이식할 수 있는 기법을 개발하기 위하여 시행되었다. 공여세포는 $10{\sim}14$일령의 돼지로부터 채취된 정소에서 효소처리법을 이용하여 회수하였고, recipient의 정소 내로 이식하기 전 형광 마커(PHK26)로 표지하였다. 외과적 수술을 통하여 recipient 돼지부터 정소를 꺼낸 후 초음파 기기와 이식 장치를 이용하여 형광표지된 공여세포를 recipient 정소의 세정관 내로 이식하였다. 14주령의 recipient 정소에 $5{\sim}7ml$의 공여 세포부유액을 주입하여 정소 내 50% 이상의 세정관 내로 새포부유액의 주입이 가능하였고, 세포부유액이 주입된 세정관 내에서 형광표지된 정소세포들이 고루 이식되어짐이 관찰되었다. 본 연구에서 개발한 이식 기법을 이용하여 효율적인 정소세포의 이식이 가능함에 따라 향후 돼지 정원줄기세포의 연구 및 활용법 개발에 획기적인 돌파구가 마련될 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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