• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권1호
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• pp.25-31
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• 2003

아닐린을 분해할 수 있는 Deiftia acidovoran 51-A가 기존에 분리되어 아닐린 분해능이 우수함이 보고되었다. 이 균주로부터 아닐린 분해관련 유전자를 선발하기 위하여 Tn5-B20삽입 변이체들을 유도하여 영양요구형이 아니면서 아닐린을 분해할 수 없는 변이균주 D. acidovorans 10-4-2 균주를 선발하였다. Southern hybridization 결과 이 변이균주에는 Tn5-B20이 한 copy만 삽입된 것으로 나타났다 이 변이균주의 Tn5-B20삽입의 인접 유전자들을 분리하여 염기서열을 분석한 결과 아닐린 분해의 첫 단계에 해당하는 아닐린의 catechol로의 산화적 deamination에 관련되어 있는 것으로 추정하는 tdnQ, tdnT tdnAl 유전자들이 동정되었고 Tn5-B2O은 tdnAl의 바로 밑에 삽입된 것을 알 수 있었다. TdnA2 및 downstream의 유전자 기능을 상실하여 아닐린을 catechol로 전환하는 과정에 변이가 발생하고 따라서 아닐린을 탄소원으로 이용하지 못하는 표현형을 가지게 된 것으로 결론지을 수 있었다. Tn5-B20 의 일부 DNA 조각을 probe로 Southern hybridization 결과 transposon 삽입이 대형의 플라스미드에 삽입된 것으로 나타나 tdn 유전자들이 pTDN51이라고 명명한 100-kb 이상의 대형 플라스미드에 위치함을 알 수 있었다. 이상의 결과는 D. acidovorans 51-A의 pTDN51상의 tdn유전자들이 아닐린의 분해에 관여함을 보여준다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권3호
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• pp.226-235
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• 2017

Phytoene, lycopene, ${\beta}-carotene$과 같은 카로티노이드는 식품의 착색제나 영양보조제, 사료첨가제, 화장품의 원료로 사용된다. 이전 연구에서 본 연구진은 분홍색의 색소를 생산하는 새로운 해양 세균인 K. gwangalliensis를 분리 동정하였다. Phytoene desaturase (CrtI) 효소는 crtI 유전자에 암호화되어 있으며, phytoene을 lycopene으로 전환하며, 카로티노이드 합성 초기 단계에 있어서 필수적이다. CrtI는 카로티노이드 생합성 조절의 주요 효소 중 하나이며, 다양한 카로티노이드를 생합성하는 생물들의 카로티노이드 생합성 경로에 있어서 속도 조절 단계에 관련이 있다. 본 논문에서는 K. gwangalliensis로부터 lycopene 생합성을 담당하는 crtI 유전자를 클로닝 하였으며, 이 유전자는 1,584개의 염기서열을 가지며, 527개의 아미노산을 암호화하고 있다. crtI 유전자의 염기 서열을 Kocuria rhizophila와 Myxococcus xanthus를 포함한 다른 종의 염기 서열과 비교한 결과, 진화 과정에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다. crtI 유전자를 포함하는 발현 플라스미드를 구축하여 발현시킨 결과, 이 플라스미드를 함유하는 대장균은 약 57 kDa의 재조합 단백질을 생산화였으며, 이는 phytoene desaturase의 분자량에 해당한다. lycopene의 생합성은 lycopene 생합성에 필요한 crtE, crtB 유전자를 포함한 pRScrtEB plasmid를 E. coli에 형질전환 했을 때, Escherichia coli에서 합성되는 것을 확인하였다. 이 연구의 결과는 분자 수준에서 K. gwangalliensis CrtI의 1차 구조에 대한 폭 넓은 지식 기반을 제공할 것이다.

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.305-310
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• 2009

플라스미드 pGKV21에는 229-nt single-strand DNA initiation (ssi) signal이 존재한다. Asymmetric PCR 기법으로 합성된 229-nt ssDNA 단편을 이용하여 실제로 RNA polymerase에 의한 priming ability와 protein interaction을 확인하였다. in vitro primer RNA 합성 실험 결과, 229-nt ssDNA 단편은 filamentous M13 phage의 주형 DNA에서와 비슷한 효율로 시발체 RNA를 합성하였으며, 이 반응은 strand-specific하게 이루어졌다. DNase I footprinting과 gel retardation 실험 결과, RNA polymerase와 SSB 단백질은 229-nt ssDNA 단편에 stable interaction을 하며, 시발체 RNA를 합성하였다. 또한, in vivo 조건 하에서 RNA polymerase의 저해제인 rifampicin을 처리하여 세포내에 ssDNA 중간체가 집적되는 정도를 비교하여 본 결과, 플라스미드 pGKV21은 rifampicin-sensitive RNA polymerase가 상보가닥 합성에 관여 함을 보여 주었다.

• 미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.205-210
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• 1999

Vibrio cholerae 는 사람에게 설사를 일으키는 병원성 세규닝며 본 연구에 이용된 V.cholerae KNIH002 는 국내의 설사질환 환자로부터 분리하였다. 콜레라 독소 검출용 프라이머를 이용하여 PCR 로 증폭한 산물을 탐침자로 이용하여 Southern hybridization을 실시한 결과 PstI 및 BglII로 이중절단된 4.5-kb 절편내에서 ctx 유전자가 존재함을 확인하였다. 따라서 염색체 DNA를 PstI 및 BglII로 절단 후 V. cholerae KNIH002 의 유전자 mini-libraries를 제조하였다. 그리고 동일 탐침자를 이용하여 colony hybridization을 실시한 결과 제조된 유전자 mini-libraries 로부터 신호를 나타내는 한 개의 클론을 선발하였다. 선발된 클로닝 지니는 플라스미드를 pCTX75 라 명명하였으며, 이 클론은 CHO 세포에 대한 세포 독력이 나타남을 확인하였다. 염기서열을 결정한 결과 클로닝된 플라스미드에는 ace 와 zot 유전자들은 각각 ATG 개시코돈과 TGA 종결코돈을 포함하여 291 bp와 1,200 bp 로 구성되어져 있었다. ace 유전자의 염기서열은 V.cholerae E7946 EI Tor Ogawa strain 이 것과 100% 일치하였다. 그러나 zot 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 V. cholerae 395 Classical Ogawa strain 의 것과 각각 99% 및 98.8% 의 상동성을 보였다. 특히, V.cholerae 395 Classicale Ogawa strain 의 Zot 폴리펩타이드에서 100번, 272번, 281번째 alanine 은 V.cholerae KNIH002에서 모두 valine 으로 치환되어져 있었다.

• 미생물학회지
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• 제50권3호
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• pp.185-190
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• 2014

원유시료에서 분리한 대장균의 quinolone 항생제 내성비율과 그 내성 결정인자를 분석하였다. 원유시료에서 대장균을 분리하고 quinolone 항생제인 nalidixic acid와 ciprofloxacin에 대한 MIC값을 결정하였으며 내성균을 대상으로 염색체상에 있는 quinolone 내성 결정부위(quinolone resistant determining region, QRDR)인 gyrA, gyrB, parC, pareE의 염기서열 분석, 플라스미드상에 존재하는 내성유전자(plasmid mediated quinolone resistant, PMQR) qnrA, qnrB, qnrS, aac(6')-lb-cr, qepA의 분석 및 약물 유출펌프 유전자인 acrB의 발현을 비교 분석하였다. 그 결과 총 487개의 대장균군 세균중 9개의 균이 nalidixic acid에 내성임을 확인하였으며($MIC{\geq}64{\mu}g/ml$) 이중 6개 균주가 ciprofloxacin에도 내성임을 확인하였다(MIC $4-16{\mu}g/ml$)). 9개의 내성 균주 모두 QRDR의 gyrA 영역 codon 83에 변이(S83L)를 갖고 있었으며 그 중 2균주는 codon 83과 87 (S83L and D87N)에 이중 돌연변이를 갖고 있었다. 한편 9균주 중 3개의 균주에서 parC 영역 codon 80 (S80I)에 변이를 갖고 있었다. 플라스미드 상에 존재하는 내성유전자인 qnrA, qnrB, qnrS, aac(6')-lb-cr 및 qepA 유전자는 존재하지 않았으며 AcrAB-TolC efflux pump 유전자인 acrB 유전자가 대조균인 E. coli ATCC 25922와 비교하여 ciprofloxacin 내성 균주 6균주 중 4균주에서 유의적으로 과발현(2.15-5.74배) 되고 있음을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.263-268
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• 1989

유전자의 재조합 균주의 생산성을 향상시키기 위한 발효시스템 개발을 목적으로 regulated promoter 인 SUC2 gene 갖는 유전자 재조합 S. cerebisiae를 모델로하여 유전자 산물인 Invertase 발현에 미치는 글루코오스 농도의 영향, 발효 중 플라스미드의 불안정성, 생육특성 및 continuous fed batch system을 연구하였다. 유전자 재조합 균주는 biphasic growth 현상을 보였으며 글루코오스 농도가 0.9g/$\ell$에서 2.2g/L로 증가함에 따라 비증식 속도는 0.224 h$^{-1}$에서 0.226 h$^{-1}$로 증가했으며 숙주효모보다 낮은 값을 나타내었다. 유전자 재조합 균주의 invertase 생산은 발효조내의 글루코오스 농도에 크게 영향을 받아 글루코오스 농도가 0.25~0.4g/L로 감소될 때 invertase 생산이 시작되었으며 회분발효중 플라스미드의 분리는 글루코오스 자화기간 동안에 빈번히 일어났으나 에탄을 자화기간에는 완만해지는 경향을 보였다. 또한 통기를 해주지 않고 배지의 용존산소만으로 배양시킨 결과 통기를 한 경우에 비하여 invertase의 비활성과 총활성이 각각 1.5 및 1.3 배 증가되었다. 균체의 증식단계와 유전자의 발현단계로 구분하여 발효시키기 위하여 영양분을 함유한 글루코오스 용액을 48m1/h(0.096g 글루코오스/48L의 유량으로 12시간 연속적으로 공급하여 fed batch 배양한 결과 invertase의 비활성과 총활성이 비통기적 회분배양 보다 각각 1.74, 2.74배 증가되었다.

• 생명과학회지
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• 제19권12호
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• pp.1718-1723
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• 2009

Chromosomal 인 SHV-11 $\beta$-lactamase가 plasmid를 매개로 다른 균주로 전달 되는 현상은 흔하지 않다. 본 연구에서는 플라스미드성 SHV-11 $\beta$-lactamase를 동시에 가지고 있는 ESBL생성 두 균주를 검출하였다. 따라서 이들 균주에 대한 유전적 특성과 임상적 의의에 대해 알아보고자 하였다. Vitek system과 이중디스크확산법을 이용하여 ESBL생성균주를 검출하였고, PCR과 DNA 염기서열분석을 이용하여 SHV-11 $\beta$-lactamase를 가지고 있는 ESBL생성균주를 확인 하였다. 이들 균주를 교차접합실험과 형질전환실험을 이용하여 유전자전이를 확인하고 액체배지 희석법으로 3세대 cephalosphorin 항생제에 대한 최소억제농도를 측정하였다. 이들 균주의 유전형 분석결과는 SHV-11 $\beta$-lactamase 유전자와 CTX-M-15 ESBL 유전자를 동시에 가지고 있었다. 3세대 cephalosphorin 항생제에 대한 최소억제농도는 SHV-11 $\beta$-lactamase와 CTX-M-15 ESBL 유전자를 동시에 가지고 있는 균주에서 $64{\mu}g/ml$ 이상이었고, SHV-11 $\beta$-lactamase 만을 가지고 재조합 한 균주에서 $0.5{\mu}g/ml$ 이하로 나타났다.

• 대한임상검사과학회지
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• 제48권2호
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• pp.118-123
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• 2016

지난 반세기 동안 세균 감염증 치료 또는 성장촉진을 목적으로 가금류에게 광범위하게 항균제를 사용해 왔다. 그러나 항균제 내성의 증가는 사람에게 보편적으로 사용되는 항균제들에 대한 내성을 유도하여 치료를 위한 항균제 선택에 제약을 주어 치료에 어려움을 가중시키고 있다. 본 연구에서는 경상도 지역에서 사육된 닭으로부터 분리된 장내세균을 대상으로 ${\beta}-lactam$, quinolone, 및 aminoglycoside 계열 항균제에 대한 내성유전자의 빈도를 조사하였다. 그리고 항균제 감수성 검사를 시행하여 내성유전자와의 관련성을 알아보았다. 본 연구에서 총 43균주의 장내세균이 40마리의 닭의 맹장으로부터 분리되었으며 디스크확산법을 이용하여 항균제 감수성 검사를 시행하였다. 그리고 중합효소연쇄반응과 염기서열분석을 통해 플라스미드 매개 항균제 내성 유전자를 조사하였다. 총 43균주 중 2균주가 $bla_{CTX-M-14}$ 유전자를 포함하고 있었으며 qnrS 및 aac(6')-Ib-cr 유전자도 각각 2균주와 5균주에서 확인되었다. 총 43균주를 대상으로 항균제 감수성을 조사한 결과 cefepime, ceftazidime, 및 cefaclor를 제외한 모든 항균제에 대해 0.0%부터 23.3%까지의 낮은 감수성률을 보였다. 본 연구에서는 닭으로부터 분리된 대장균에 플라스미드 매개 항균제 내성유전자가 확산되어 있음을 확인하였다. 항균제 내성 유전자의 확산을 막기 위해서는 지속적인 항균제 내성유전자의 조사와 감시가 필요할 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제37권4호
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• pp.253-258
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• 2001

Bacillus circulans KCT3004 기원의 $\beta$-1,3-glucanase 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pLM460과 pUB110을 이용하여 shuttle 플라스미드 pMLS1180을 제작하고 Bacillus 세포에 이동.발현시켰다. pLMS1180으로 형질전환된 B. subtilis와 B. megaterium은 효율적으로 $\beta$-1,3-glucanase를 생산하였고, 이 효소들은 세포의 증식과 비례하여 생산되었다. 형질전환체가 생산하는 $\beta$-1,3-glucanase의 최대 활성을 유전자 공여 균주인 B. circulans와 비교하여 보니, B. subtilis는 14배, B. megaterium은 5배 정도의 높은 활성을 나타내었다. 그리고 대장균 형질전환체는 분비율이 7% 정도인데 반하여 B. subtilis 형질전환체는 생산된 효소를 전부, B. megaterium 형질전환체는 약 97%를 세포 외로 분비하는 것을 알 수 있었다. SDS-PAGE를 통해 대장균과 B. subtilis, B. megaterium에서 발현된 효소의 분자량을 분석해 보니 약 38,000으로 추정되었다. 또한, 이들 형질전환체가 생산하는 $\beta$-1,3-glucanase는 laminarin에 작용하여 주된 산물로서 laminaribiose (G2), laminaritriose (G3) 이상의 다양한 laminarioligosaccharide들을 생산함이 확인되었다. pLMS1180의 각 숙주 내에서이 안정성을 살펴본 결과 B.megaterium에서는 88%, 대장균에서는 75%, B. subtilis에서는 48%로 나타났다.

• 한국초지조사료학회지
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• 제17권4호
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• pp.379-386
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• 1997

대만산 배추 (Brassica campestris M.)로부터 분리한 BcHSPI7.6 cDNA(내열성 유전자)를 pBKSl-l vector에 subcloning하므로서, NPTII 유전자와 P35S-HSPI7.6 cDNA를 가지는 pBKH4 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드를 갖는 A. tumefaciens LBA4404로서 담배잎 단편을 24시간 동안 공배양하므로서 감염시켰으며, 이들 유전자로 형질전환된 shoot는 $100\;{\mu\textrm{g}}/ml$의 가나마이신을 첨가한 MS-n/B 배지에서 선발하였다. 담배((Nicotiana. tabacum)의 열에 대한 치사온도는 $50^{\circ}$에서 15분 이상이었으며, BcHSPI7.6 cDNA를 갖는 형질전환된 식물체는 이 온도에서 내열성을 나타내었다. 식울체의 형질전환 여부는 ${\alpha}^{_32}P$로 표지한 BcHSPI7.6 cDNA 단편을 probe로 이용해서 Southern blot hybridization을 실시하므로서 확인하였다. BcHSPI7.6 cDNA의 발현정도는 Northern blot 분석과 이중면역확산 방법으로 확인하였다. 본 연구에서, 담배에 도입한 BcHSPI7.6 cDNA는 내열성과 관련이 있는 유전자로서, HSPI7.6 단백질은 식물체를 열에 의한 손상으로부터 방지해 주는 protector 역할을 하는 것 으로 사료된다.