In vivo와 in vitro 생물검정법에서의 활성관계를 조사하고 또한 보다 효율적인 in vitro 검정법을 개발하기 위하여 작용기구가 다른 두 계열 살균제 즉 sulphamide계 (dichlofluanid와 tolylfluanid)와 dicarboximide계 살균제 (iprodione, vinclozolin 및 procymidone)을 시험약제로 하여 본 실험을 수행하였다. Dichlofluanid, tolylfluanid, iprodione, vinclozolin procymidone의 토마토 유묘에서의 병 방제효과는 유사하였다. 그러나 이들 살균제에 대해 in vitro 생물검정법으로 항균활성을 비교한 결과, sulphamide계 살균제는 포자발아 억제실험에서 높은 활성을 나타낸 반면에, dicarboximide계 살균제는 균사생장 억제실험에서 항균활성이 더 우수하였다. 그러므로 in vivo 병 방제효과가 유사하더라도 작용기구가 다르면 in vitro 생물검정법에서의 항균활성은 다르게 나타남을 알 수 있었다. 또한 포자현탁액을 넣은 96-well microtiter plate에 약제를 처리하고 3시간 배양 후 배양액을 제거하고 다시 새 배지를 넣어 배양한 후 생장억제를 조사한 실험 (microtiter plate method I, MPM I)에서는 살균제들의 포자발아 억제실험과 유사한 경향의 활성을 보였다. 96-well microtiter plate에서 포자현탁액을 6시간 동안 배양하여 포자를 발아시킨 후에 약제를 처리한 실험(microtiter plate method II, MPM II)에서의 항균활성은 균사생장 억제효과와 일치하는 경향을 보였다. 따라서 기존의 in vitro 항균활성 실험보다 편리하고 효율적인 MPM I과 II 방법은 각각 포자발아와 균사생장 억제실험을 대신할 수 있으리라 생각되었다.
본(本) 연구(硏究)는 한국산(韓國産) 사과 점무늬낙엽병균(Alternaria mali)을 공시(供試)하여 그들의 병원성(病原性)과 기주특이적(寄主特異的) 독소생성(毒素生成)과의 관계를 조사하고 감염성립(感染成,立)에 있어서 독소(毒素)의 역할(役割)과 그 생물활성(生物活性)을 알아 보기 위하여 실시하였던 바 그 결과(結果)를 요약(要約)하면 다음과 같다. 1. 사과나무 잎의 병반(病斑)에서 분리(分離)한 5개(個)의 Alternaria 균주(菌株)중에서 3균주(菌株)만이 병원성(病原性)이 있었고 2균주(菌株)는 병원성(病原性)이 없었다. 병원성균주(病原性菌株)의 배양여액(培養濾液)중에는 감수성품종(感受性品種)에만 잎맥괴사(壞死)를 일으키고 저항성품종(抵抗性品種)에는 잎맥괴사(壞死)를 일으키지 않는 기주특이적독소(寄主特異的毒素)를 생성(生成)함을 알 수 있었으며 비병원성균주(非病原性菌株)는 이런 독소(毒素) 생성(生成) 능력(能力)이 없었다. 2. 병원균(病原菌)의 배양여액(培養濾液)에서 단리(單離)한 기주특이적(寄主特異的) 독소(毒素)인 AM-toxin은 $10^{-5}M$의 낮은 희석농도(稀釋濃度)에서 감수성품종(感受性品種)에는 매우 심한 잎맥괴사(壞死)를 일으켰고 중도감수성품종(中度感受性品種)에는 약한 잎맥괴사(壞死)를 일으켰으며 저항성품종(抵抗性品種)에는 전혀 식물독성(植物毒性)을 나타내지 않았다. 3. 병원균(病原菌)은 포자발아시(胞子發芽時)에도 AM-toxin을 생성(生成)하였으며 포자발아액중(胞子發芽液中)의 AM-toxin 분비(分泌)를 경시적(經時的)으로 조사하였던 바 포자발아(胞子發芽) 직후인 2시간째부터 독소(毒素)를 방출(放出)하였고 그 양(量)은 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 4. 병원균(病原菌)의 포자현탁액(胞子懸濁液)을 감수성품종(感受性品種)의 잎에 분무접종(噴霧接種)하면 감염(感染)에 수반하여 접종(接種)잎으로부터 전해질(電解質)의 다량유출현상(多量流出現象)이 일어났으며 기주특이적독소(寄主特異的毒素)(AM-toxin)용액(溶液)을 흡수(吸收)시켜도 같은 현상(現象)이 일어났다. 그러나 저항성품종(抵抗性品種)의 잎에서는 독소(毒素)처리나 포자접종(胞子接種)의 어느 경우에는 전해질다량유출현상(電解質多量流出現象)이 일어나지 않았다. 5. 병원균(病原菌)의 포자발아액(胞子發芽液)이나 AM-toxin용액(溶液)으로 비병원성균(非病原性菌)의 포자현탁액(胞子懸濁液)을 만들어 감수성품종(感受性品種)의 잎에 분무접종(噴霧接種)하면 병원균(病原菌)의 포자(胞子)를 접종(接種)할 경우와 같이 병반(病斑)이 형성되었다.
대두갈색무늬병균의 포자발아(分生胞子發芽) 미치는 외부영양공급(外部營養供給) 및 self-inhibitor의 영향(影響)을 조사하여 다음과 같은 결과(結果)를 얻었다. 1. 갈색무늬병균의 포자발아율은 감자한천배지 및 대두잎조각을 첨가한 증류수에서는 양호하였으나 살균된 증류수에서는 극히 불량하였다. 2. 갈색무늬병균의 포자발아에는 탄소원의 외부공급이 절대 필요한 것으로 보였으며 인산, 가리 등은 큰 영향이 없는 것으로 보였다. 3. 탄소원으로서는 가용성 전분이 가장 효과적이었고 다음이 포도당, 유당 등이었으며 포도당의 경우 $5\times10^{-2}mol$ 농도에서 가장 높은 발아율을 보였다. 4. 포자발아율은 포자밀도가 높을수록 현저히 감소하여 포자농도 $10,000conidia/mm^2$ 이상에서는 거의 발아하지 않는 것으로 보아 self-inhibitor가 존재하는 것으로 보였다. 5. 기질(基質)을 세척한 포자의 발아율은 세척하지 않은 포자의 발아율에 비해 낮았으며 이러한 현상은 포자농도가 $2,000conidia/mm^2 $ 이상으로 증가할 때 더욱 현저하였고 건조된 한천배양기위에는 발아율 감소가 현저하였다.
배양온도 및 배지의 pH가 인삼 뿌리썩음병균 Cylindrocarpon destructans 후막포자의 발아에 미치는 영향을 배지별로 조사한 결과는 다음과 같다. 배양온도별 후막포자 발아율은 Czap다 solution agar(CSA) 배지가 potato dextrose agar(PDA) 보다 높았다. CSA 배지의 경우에는 배양온도 5~3$0^{\circ}C$에서 후막포자의 발아가 가능하였으며 15~$25^{\circ}C$에서 발아율은 53.2~62.7%로서 발아적정 온도범위로 측정되었다. 후막포자 발아 최적 배양온도는 2$0^{\circ}C$로 발아율은 62.7%이었고, 3$0^{\circ}C$에서는 6.9%의 매우 저조한 발아율을 보였다. PDA배지에서는 5~$25^{\circ}C$에서 후막포자가 발아 가능하였고, 3$0^{\circ}C$에서는 발아가 관찰되지 않았다. 10~2$0^{\circ}C$에서 발아율이 43.6~47.9%로서 발아적정 온도범위로 측정되었다. 후막포자 발아최적 배양온도는 2$0^{\circ}C$로 발아율은 47.9%이었다. C. destructans 후막포자는 CSA 배지의 pH 5.2~8.1 조사범위 전체에서 발아되었으며 발아적정 pH 범위는 pH 6.4~8.1이었다. PDA배지의 경우는 pH 5.2~7.4의 조사범위 전체에서 발아가 확인되었으며 발아적정 pH 범위는 pH 5.2~6.0 이었다. C. destructans 후막포자를 21일간 배양한 후 생성된 균총의 색상을 배지 pH별로 조사한 결과, CSA 배지의 경우 pH 5.2~6.0 범위에서 연한 갈색, pH 6.4~8.1 에서 백색의 균총을 형성한 반면, PDA 배지에서는 pH 5.2~7.1에서 C. destructans의 전형적인 암갈색 균총을 형성하였고 pH 7.2에서는 갈색균총을 형성하였다.
본 연구는 좀나도히초미(Polystichum braunii (Spenn.) $F{\acute{e}}e$)의 효율적인 증식방법을 규명하기위해 기내 포자발아, 전엽체 증식, 기회 포자체 형성 등 단계별 배양조건을 찾고자 수행되었다. 포자 발아율과 초기 전엽체 발달은 무기물 함량이 적은 Knop 배지에서 41.2%로 가장 높았다. 전엽체의 증식 및 생식기관 형성을 위한 배지는 2% sucrose가 포함된 2 MS 배지였다. 또한 배양토 종류와 혼합비율을 달리하여 전엽체를 기외 이식한 결과, 원예용 상토와 마사토를 2:1 혼합한 배양토에서 재배하였을 때 포자체 형성이 276.3개/$7.5m^2$로 가장 많았다. 반면, 피트모스가 포함된 조건에서는 전엽체 증식 및 포자체 형성이 억제되었다. 포자체 육묘는 상토 단용처리구에서 재배하였을 때 생육이 가장 왕성하였다.
당근검은잎마름병균인 Alternaria dauci KACC42997에 대해서 32개 살균제를 선발하여 균사생장 억제효과를 조사한 결과, '다2'군, '다5'군, '사1'군, '마2'군, '마3'군에 속하는 살균제의 균사생장 억제효과가 우수하였다. Iminoctadine tris-albesilate를 제외한 '카'군에 속하는 보호살균제와 '다3'군에 속하는 pyraclostrobin은 병원균의 포자발아를 억제하는 효과가 우수하였다. 균사생장 억제효과가 우수했던 숙신산탈수소효소 활성을 저해하는 '다2'군과 탈메틸효소 활성을 저해하는 '사1'군 살균제는 우수한 균사생장 억제효과를 보여주면서도, 포자발아 억제효과는 저조하였다. 하지만 '다5'군에 속하는 fluazinam은 균사생장 억제효과뿐만 아니라 포자발아 억제효과도 우수하였다. 특별히 '다2'군에 속하는 fluxapyroxad를 100 ㎍/ml 처리한 경우, 배지 상에서 포자형성을 47.1% 억제하였다. 구미, 평창, 제주 등에서 분리한 검은잎마름병균 집단의 '사'군, '다'군, '마'군 살균제에 대한 저항성 요인값을 비교하면, 제주 지역 병원균 집단의 저항성 요인값이 가장 낮았다. 평창 지역 균주 집단에서 '마2'군에 속하는 fludioxonil 저항성 균주가 2개 발견되었으며, 그들은 모두 iprodione과 procymidone에 대해서 교차저항성을 보였다.
오이덩굴쪼김병균 Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum의 소형분생포자는 물한천배지상에서 Fe-EDDHA를 처리하였을 때 시간이 경과됨에 따라 발아율이 증가되어 무처리와 유의차를 보이지 않았으나 발아관의 길이는 현저하게 짧았다. Pseudomonas putid의 Siderophore를 처리하였을 때는 포자의 발아율과군사신장이 모두 현저하게 억제되었다. 토양중에 형성된 후막포자가 발아하는데 필요한 영양물질로 Glucose; Peptone을 각각 $0.25\%$씩 첨가하였을 때 $90\%$에 달하는 높은 발아율을 나타냈고, Glucose $0.25\%$와 Asparagine $0.25\%$를 첨가한 처리도 $86\%$의 발아율을 보였다. 오이의 근권토양에서 후막포자는 발아후 10일된 유묘에서 $25\%$의 발아율을 보인 반면 2일된 유묘에서는 $14\%$ 정도 밖에 안되었으며, 10일 이상 경과된 묘에서도 발아율이 증가되지 않았다. 근권토양에 Fe-EDDHA를 첨가한 처리와 P. putida를 접종한 처리는 후막포자의 발아를 현저히 억제하였으며, 근권부위에 영양물질을 첨가한 처리에서도 같은 경향이었다. 그러나 비근권토양에 영양물질을 첨가하여 후막포자를 발아시켰을 경우 Fe-EDDHA나 P. putida의 발아 억제 효과가 뚜렷하게 인정되지 않았다. 근권토양에서 후막포자 발아 억제효과는 Fe-EDDHA보다 P. putida를 접증한 처리가 더 큰것으로 나타났다.
본 실험에서는 당근 검은잎마름원균의 포자 발아 및 생존에 영향을 끼치는 온도, 상대습도, pH와 건조시간에 대하여 조사하였다. 분생포자의 발아는 $15-25^{\circ}C$ 사이에서 95% 이상의 상대습도 조건에서 촉진되었으나, $5^{\circ}C$에서는 상대습도와 상관없이 발아율이 급격히 감소하였다. 병원균의 분생포자 발아를 촉진하는 최적 환경조건은 습도 95% 이상, 온도 $15-25^{\circ}C$, pH 7.0 및 당근 잎 추출물 0.2%로 확인되었다. 또한 분생포자는 건조시간이 경과함에 따라 발아율이 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나 분생포자는 수분 없이 12시간까지 생존 가능하였으며, 수분이 재공급될 경우에는 10% 정도의 발아율을 보였다. 이러한 결과는 A. dauci의 포자 발아 및 발생 생태를 이해하는데 유용한 정보를 제공할 것으로 생각된다.
효율적인 고추 탄저병 방제를 위하여, Colletotrichum gloeosporioides에 대한 살균제 13종의 포자 발아, 균사 생장 및 포자 형성 억제효과를 실험하였다. 이들 살균제 중 captan과 chlorothalonil, dithianon, fluazinam 및 folpet은 0.8 ${\mu}g/ml$ 농도에서 C. gloeosporioides 포자의 발아를 완전히 억제하였다. 이들 살균제 보다 억제효과는 낮았으나, mancozeb와 propineb도 20 ${\mu}g/ml$에서 80% 이상의 포자 발아 억제율을 나타내었다. 고추 탄저병균의 균사 생장은 fluazinam과 nuarimol에 의해 강하게 억제되었다. Nuarimol을 제외한 살균제들은 C. gloeosporioides의 균사 생장보다 포자 발아를 더 효과적으로 억제하였다. 그리고 Strobilurin계 살균제인 azoxystrobin과 metominostrobin은 고추 탄저병균의 포자 발아와 균사 생장에 대한 억제효과는 낮았으나, 포자 형성을 효과적으로 억제하였다. 그러므로 nuarimol을 제외한 이들 살균제를 이용한 고추 탄저병 방제는 주로 예방적으로 약제를 처리하여야 할 것으로 생각되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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