L-트립토판이 충족된 사료에 0.015%의 L-트립토판이 더 첨가된 사료를 이용종계 PS(Hubbard) 1768수에 34주령부터 52주령까지 133일간 급여하여 산난율, 종난율, 수정률, 규격병아리수를 조사하여 대조사료를 급여한 1105수의 값들과 비교하였다. L-트립토판을 급여한 종계는 급여개시 후 7주간인 피크산란기에는 대조사료를 급여한 것과 비슷한 산난율을 보였으나, 피크기 이후 84일(41-52주령)간과 급여중지후 28일간(53-56주령)에는 대조사료를 급여한 것에 비해서 유의하게(P<0.05) 높은 산난율을 보였다. 종난율도 피크기 이후와 급여중지후의 조사기간에 L-트립토판을 급여한 것에서 대조사료를 급여한 것보다 유의하게 (P<0.01) 높았고, 실험사육 전기간의 평균종난율도 L-트립토판급여에 의해서 유의하게 (P<0.05) 높았다. 한편 산난율과 종난률의 변동률은 시험사료를 급여한것에서 대조구의 값들보다 일반적으로 낮았다. 수정률과 부화율은 L-트립토판급여의 영향이 관찰되지 않았으나, 규격병아리수는 L-트립토판을 급여하면 대조에 비해서 유의하게 (P<.05) 높았다. 그리고 수정률, 부화율 및 규격병아리수에 대한 변동률도 L-트립토판을 급여하면 일반적으로 낮아졌다. 이상과 같이 L-트립토판을 그 요구량 이상으로 첨가한 사료를 급여하면 종란율과 규격병아리수가 높아진다는 것을 나타내고 있다.
대장균 트립토판 중합요소 (tryptophan synthase) $\alpha$ 소단위체의 24번 잔기인 트레오닌이 메티오닌, 알라닌 또는 세린으로 치환되고 잔기 139에 트립토판이 있는 단백질를 정제하여, 여러가지 요소 농도에 대한 트립토판 형광값의 변화를 측정하여 변성곡선을 얻었다. 이들 단백질들은 모두 F139W 단백질에 비해 구조형성 성질에 큰 변화를 일으켰으며, 잔기 24번은 구조형성에 중요한 것으로 추정된다.
Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)에 의한 트립토판 대사체의 생성은 T 세포에 강력한 억제효과를 미치지만 여전히 그 작용기전에 대한 연구보고는 미비한 실정이다. 본 연구자는 트립토판 대사체 3-HAA가 선택적으로 활성 T 세포의 사멸을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였고, 이는 세포주기 억제와는 관련이 없었다. 3-HAA 처리 시 활성 T 세포에서 TRAIL과 그의 수용체의 발현이 현저히 증가하고, 이들 상호작용을 차단하였을 때 3-HAA-매개 활성 T 세포사멸 효과가 유의하게 낮아졌다. 본 연구를 통해 트립토판 대사체 3-HAA의 선택적 T 세포 억제 효과가 TRAIL-유도 세포사멸과 관련됨을 알 수 있다.
대장균 변이주를 이용한 L-트립토판의 최적생산을 위해 목적산물의 생산과 유기산의 생성과의 상호관계를 조사한 결과 비 산생성속도(specific acid production rate)가 증가할수록 L-트립토판의 생산이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 L-트립토판 발효시 산의 생성량을 줄이기 위해 조절식 유가배양법을 도입하였는데 이 배양공정에서는 배양액내의 용존산소농도에 따라 영양배지의 유가속도를 조절하는 방식을 사용하여 세포증식속도를 제한, 세포의 산소요구량이 공급량을 초과하지 않도록 하였다. 이러한 조절식 유가배양법으로 대장균 세포를 배양한 결과 기존의 유가배양식에 비해 비 산생성속도가 현저하게 감소하였으며 L-트립토판의 생산은 5배 정도나 증가되었다.
Anthranilate synthase (AS)는 트립토판(Trp)과 indole-3-acetic acid, indole alkaloids의 생합성 경로에서 중요한 효소로 작용한다. 트립토판 생합성 상에서 feedback inhibition에 민감하게 반응하는 AS alpha-subunit 관련 OASA2 유전자 영역의 single (F124V) 및 double (S126F/L530D) 점돌연변이로 변형된 유전자의 재조합운반체를 작성하고 이들 유전자들을 Agrobacterium 방법으로 동진벼에 도입하여 형질전환체를 육성하였다. Single 및 double 돌연변이 OsASA2 유전자가 도입된 형질전환 벼 계통들은 nos gene probe를 이용한 TaqMan PCR 방법으로 single copy를 선발하였고, intergenic 계통을 선발하기 위해서 Bfa I 제한효소를 이용하여 RB와 LB 인접서열로부터 IPCR을 통한 FST 분석을 수행하여 4 개의 intergenic 계통을 선발하였다. 도입된 유전자의 발현으로 형질전환 벼는 Trp, IAN 및 IAA가 잎에 가장 많이 축적되었고, 종자의 트립토판 함량도 증가되었다. 후대에서 tryptophan 함량이 높은 S-TG와 D-TG의 두 호모 이벤트 계통을 육성하여 트립토판 함량을 분석한 결과 대조구에 비하여 13~30배 이상 높게 나타났으며, 유리아미노산의 함량도 증가하였다. 이벤트 계통을 이용하여 microarray 분석을 수행한 결과 세포 내 이온 수송, 영양분 공급 등에 영향을 주는 유전자군들이 up-regulation 되었고, 세포 내 기능유전자의 역할을 담당하는 조효소 등이 down-regulation 된 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 선발된 두개의 상동성 이벤트 계통들이 고함량의 유리 트립토판 생산 벼의 육종에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준 결과로 생각된다.
$Chirobiotic^{(R)}$ T HPLC 컬럼을 이용하여 D, L-트립토판을 분리하였다. 이동상으로 메탄올과 증류수를 각각 70/30, 80/20, 90/10의 비율로 사용하고 체류시간을 비교하기 위해 온도를 25, 40, $55^{\circ}C$로 변화시켰다. 이동상 조성비를 변화시켜 D-트립토판과 L-트립토판의 체류시간 차이를 조사하였다. 선택도와 분리도, 컬럼의 효율성을 체류시간 관점에서 계산하여 최적의 분리 조건을 찾는 실험을 하였다. 이동상에서 메탄올의 양이 감소함에 따라 트립토판 체류시간이 짧아지고, 컬럼의 온도가 증가함에 따라 체류시간도 감소한다. 메탄올과 증류수의 비가 70/30일 때와 온도가 $25^{\circ}C$일 때 가장 좋은 선택도와 분리도를 얻었다.
트립토판 생산성을 향상시키기 위해 대장균 변이 주인 SB1007로부터 sulfanilamide 내성 균주를 유도하여 SA 3-39-16출 분리하고 이 균주로부터 tyrosine 영양요구주인 TY-90을 개발하였다. 시험관배양시 TY-90균주는 모균주보다 트립토판 생산량이 우수하였으나 발효조 배양시에는 모균주에 비해 낮은 양의 트립토판이 축적되었다. 발효조에서의 생산성 증대를 인해 또 다른 대장균 변이주인 SB2756으로부터 새로운 변이주의 개발을 모색하였다. 먼저 이중 영양요구성 균주인 SB2756의 revertant를 분리하여 그중 2,000mg/$\ell$ 농도의 $\beta$-thenylalanine에 내성을 갖는 TA-40-10을 분리하였고 이 균주로부터 phenylalanine 영향요구주인 TP-4를 개발하였다. 이 TP-4균주는 발효조에서 71시간 배양시 3.7g/$\ell$의 L-tryptophan을 생산하였다.
본 연구에서는 대장균 트립토판 중합효소(tryptophan synthase) $\alpha$ 소단위체의 폴딩에 있어 24번 잔기의 역할을 보고자 하였다. 24번 잔기인 트레오닌이 메티오닌, 알라닌, 세린, 류신 또는 리신으로 치환된 단백질를 대장균내에서 과량 발현시켜 수용성 구조의 양과 비수용성인 inclusion body양을 조사하였다. 그 결과 메티오닌이나 류신으로 치환된 $\alpha$ 소단위체는 트레오닌이 있는 소단위체와 마찬가지로 수용성 구조가 대부분을 차지하였다. 반면, 세린이나 알라닌 또는 리신으로 치환된 단백질들은 많은 양이 inclusion body로 발현되었다. 이 결과는 트립토판 중합효소 $\alpha$ 소단위체의 폴딩에 있어서 24번 잔기가 관여하고 있음을 제시하고 있다.
방향족 화합물은 화학, 식품, 고분자, 화장품, 의약 산업 등에 이용되는 중요한 물질로, 현재까지 대부분 화학 합성법 또는 식물 추출법으로 만들어진다. 그러나, 화석 연료의 고갈, 지구 온난화, 환경규제의 강화, 식물자원의 과다한 채취 등의 많은 위협요인에 직면하면서 재생 가능한 생물자원을 이용한 미생물을 이용한 생물공학적 방법으로 방향족 화합물을 생산하는 것은 매우 유망한 대안이다. 대사공학이 합성생물학과 접목되면서, L-트립토판 생합성 경로 유래의 인공 생합성 경로가 재 구축되어 5-히드록시트립토판, 세로토닌, 멜라토닌, 7-염화-L-트립토판, 7-브로모-L-트립토판, 인디고, 인디루빈, 인돌-3-초산, 바이오라세인, 데옥시바이오라세인과 같은 다양한 고부가 화합물을 생산할 수 있게 되었다. 본 총설은 이러한 방향족 화합물의 특성, 용도, 생합성 경로를 요약하였다. 또한 방향족 화합물을 미생물을 이용하여 생산하기 위한 최신의 대사공학 전략과 생산 농도를 올리는데 제기되는 문제들을 극복하기 위한 해결방안 등을 정리하여 보고한다. 시스템 대사 공학에 기반한 균주 개발과 재생 가능한 생물자원을 사용한 배지 및 생물공정의 최적화가 이루어지면 방향족 화합물의 미생물 생산을 위한 상업적으로 실행 가능한 기술 개발을 가능하게 할 것으로 예상된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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