• KSBB Journal
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• 제8권5호
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• pp.495-503
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• 1993

페퍼민트 세포의 회분배양에 의한 monoterpenoid 풍미성분의 생산 가능성과 세포의 생육 및 정유생산 특성을 알아보기 위해 캘러스로부터 얻은 모배양액 을 기포반응기 형태의 생물반응기에 접종하여 배양 하였다. 회분배양 중 접종량, abiotic stress, yeast elicitor, 그리고 2단 배양 등의 배양조건이 세포생육 과 박하정유 생성 빛 조성에 마치는 영향을 조사하 였으며 배지의 sucrose 농도와 세포생육의 kinetics 를 분석하였다. 접종량을 탈리하여 배양한 결과 2.0 %(PCV)를 접종한 경우가 반응기에서 배양이 가장 적당하였는데 배양 10일 만에 5.8g/P 의 세포생육을 얻었으며 0.109g/P 의 박하정유가 생성되였다. Abi-otic stress의 영향을 보기 위해 16시간은 $27^{\circ}C$ 에서 명상태로,8시간은 암상태로 하고 10'C로 온도를 낮추어 배양한 결과 세포의 생육은 떨어졌으나 박하정유 생성량은 0.546g/P 로 높은 수율을 보여 주었다. 사용한 Lin-Staba 배 지 에 100mg/P 의 yeast extract를 elicitor로 첨가했을 때 세포의 생육과 정유 의 생성량이 높았으며 유일하게 menthol이 정유 중 22.5%의 높은 농도로 생성되었다. 배지의 당농도를 1/2로 줄이고 $27^{\circ}C$ , 명조건으로 6일간 배양한 후 1OOmg/P 의 yeast elicitor를 첨가하여 8시간을 암 상태와 lOoe로 저온처리를 실시하여 6일간 배양한 결과 8일 이후에는 세포의 생육이 감소하였고 정유 생성량은 증가하지 않았으며 menthol도 생생되지 않았다. Dry cell yield는 O.38g dry cell/g sugar이 였으며 specific growth rate은 O.25day-1 이었다. 회분배양에 의해 박하정유가 생성됨을 알 수 있었으 냐 menthol이 생성되지 않고 전구체인 pulegone과 p piperitone이 축적되였다. 그러나 특이하게도 yeast elicitor를 첨가한 경우 menthol이 22.5%로 생성되 었는데 이제까지 박하세포 배양에 의해 생성된 men­t thol 함량으로는 최대치를 보여주는 결과이였다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제56권3호
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• pp.157-163
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• 2013

알로에의 유효성분인 다당의 효율적 생산연구일환으로 수행되었던 aloe callus의 현탁배양과 관련하여, 본 연구에서는 이의 배양생성물(세포외 다당)과 callus의 용매추출물에 대한 항염증 활성을 조사하였다. 세포외 다당(ACP)과 callus (AC)의 물 및 에탄올 추출물의 대식세포(Raw 264.7) 세포생존율을 MTT assay로 조사한 결과, AC-DMSO의 $400{\mu}g/mL$ 첨가구에서 97%로 미미한 증식저해를 보였으나 나머지 시료처리구는 모두 증식 촉진효과를 나타내었다. 또, LPS에 의해 활성화된 Raw 264.7 세포 배양액의 알로에 추출물 처리에 따른 NO 생성 저해효과를 조사한 결과, AC-DW와 AC-DMSO는 오히려 양성대 조구인 LPS 단독보다 더 많은 NO를 생성하였다. 특히, 세포외 다당 분획인 ACP-DW는 NO 생성을 강력히 억제하여 $80-100{\mu}g/mL$의 비교적 낮은 농도의 첨가로 대조구 수준까지 억제하였다. 또, Raw 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 알로에 현탁 배양 생성물의 처리에 따른 COX-2단백질의 발현정도를 조사한 결과, ACP-DW 처리구는 단독으로 COX-2 단백질을 발현시키지 않았으며, LPS 자극에 따른 COX-2의 발현감소는 미미하였다. 아울러, 활성화된 대식세포로부터 생성된 염증 사이토카인인 IL-$1{\beta}$와 TNF-${\alpha}$의 발현량을 RT-PCR로 조사한 결과, ACPDW 처리구에서 TNF-${\alpha}$의 발현이 강력하게 억제되었다. 이상의 결과들은 알로에 현탁배양 유래의 생성물들이 비교적 우수한 항염증활성을 나타냄을 보여주는 결과로, 그동안 삽목번식의 재배방법에 의존하였던 알로에 유효성분의 생산을 대체할 수 있는 효율적이고, 새로운 방법으로서의 알로에 callus의 현탁배양 가능성을 보여주었다.

• 한국식품과학회지
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• 제41권5호
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• pp.552-559
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• 2009

홍경천은 높은 약리작용에도 불구하고 특수한 배양 조건 및 낮은 번식율로 인해 홍경천 활성 성분의 대량생산이 불가능한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 환경에 구애받지 않고 대량생산 및 품질유지가 가능한 식물조직배양 공정을 통해 홍경천 조직으로부터 유도된 callus를 대상으로 초음파 추출공정을 적용하여 활성성분의 용출을 극대화 및 독성저감을 가능하게 하고 callus에 대한 항암활성을 탐색하여 홍경천 callus의 기능성 식품 소재로서 가치를 발견하고자 하였다. 인간 정상 세포인 HEK293과 HEL299에 대한 세포독성을 측정한 결과, 홍경천과 callus의 독성이 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 홍경천 callus 초음파 추출물이 전체적으로 낮은 독성을 나타내는 것으로 미루어 보아 초음파 공정을 통한 세포독성 저감효과를 확인할 수 있었으며, 조직배양 공정을 통해 홍경천의 독성 저감이 이루어지지 않은 것을 미루어 볼 때 callus가 홍경천과 같거나 비슷한 정도의 활성 성분을 함유하고 있을 것이라 사료된다. 홍경천 및 callus의 소화기, 호흡기 계통의 암세포 생육억제 활성 및 selectivity를 측정한 결과, 특히 간암 세포(HEP3B)에 대해 홍경천 및 callus 추출물의 고농도 첨가 시 암세포 저해 활성이 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, callus 초음파 추출물은 최고농도 1.0 mg/mL에서 73.19%의 암세포 생육저해 활성과 최고 5.94의 selectivity를 나타내었다. 전체적인 항암활성 측정 결과, callus 추출물에서 높은 항암활성을 나타냈으며 특히 위암 및 간암에 대한 탁월한 항암효과가 확인됨에 따라 앞으로 홍경천 및 홍경천 callus의 소화기계 암 또는 특정 암에 대한 항암활성 연구가 필요할 것으로 생각된다. 암의 예방 및 억제에 중요한 기전으로 작용할 수 있는 항산화 활성 평가를 위해 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 초음파 공정을 통한 callus 추출물에서 홍경천의 높은 항산화 작용을 확인할 수 있었다. 또한 인간 면역세포 생존율의 측정을 통해 홍경천 및 callus 추출물에 의해 면역세포가 자극을 받는 것을 확인 할 수 있었으며 대식세포의 NO-생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 면역계 세포들의 면역체계의 항상성 유지 및 antibody와 cytokine과 같은 면역물질 생성을 통한 암세포 억제 및 제거작용이 가능할 것이라 사료된다. 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 초음파 추출 공정을 적용할 시 세포독성 저감과 활성 성분 용출량의 극대화에 기인한 항암 및 암 발생과 억제 기작에 영향을 주는 항산화 및 면역증강 활성의 증가를 확인함에 따라 홍경천 callus가 기능성 항암 소재로서의 가치가 매우 높다고 사료된다. 하지만 이와 같은 홍경천 callus의 항암 소재로서 활용을 위해서는 활성성분의 용출을 극대화 할 수 있는 추출 공정의 확립과 홍경천 본래의 독성은 줄이고 암세포에 선택적인 활성을 나타낼 수 있는 활성 성분의 규명 및 정상세포 독성을 배제할 수 있는 추출물 농도의 최적화에 대한 연구가 이루어져야 하겠다.

• 한국산림과학회지
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• 제82권1호
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• pp.26-33
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• 1993

액아배양(腋芽培養)에 의한 참나무류(類) 수형목(秀型木) 4수종(상수리나무, 굴참나무, 졸참나무 및 신갈나무) 37가계(家系) 2-0묘에 대한 기내증식능(器內增殖能)을 조사(調査)하였다. 줄기증식(增殖)은 WPM에 BA 0.5mg/l와 NAA 0.01mg/l 조건(條件)에서, 발근(發根)은 GD배지(培地)에 IBA 0.5mg/l가 함유(含有)된 조건(條件)에서 시험(試驗)하였다. 줄기증식(增殖)및 발근(發根)은 가계(家系)에 따른 차이가 현저하였다. 줄기의 연속증식(連續增殖)에는 상수리나무 7가계(家系), 기타(其他) 수종(樹種)은 2가계씩 만이 가능하였다. 발근 역시 가계간 차이가 심하여 상수리나무는 전북(全北) 25, 경북(慶北) 4호 가계에서 10%를 보인 반면 전북 18호 가계에서는 89.8% 의 높은 발근율(發根率)을 보였고, 그외 수종은 매우 저조(低調)한 발근율(發根率)을 보였다. 대체로 졸참나무류의 졸참나무 및 신갈나무가 상수리나무류의 상수리나무 및 굴참나무 보다 줄기증식(增殖)이나 발근율(發根率)이 저조(低調)한 경향(傾向)이었다. 4수종(樹種)모두 줄기증식(增殖)과 발근율(發根率)과는 뚜렷한 상관성(相關性)이 없었으며 졸참나무와 신갈나무는 줄기증식(增殖)과 발근유도(發根誘導)시 정단괴저(頂端壞疽)가 크게 문제(問題)되었다. 발근시(發根時) 캘러스가 형성된 것은 토양활착(土壤活着)이 부진하였다. 참나무류 선발목(選拔木) 가계의 효율적(效率的)인 기내증식(器內增殖)을 위한 가계선발(家系選拔), 줄기연속 증식(增殖)의 저해요인(沮害要因), 기타 토양이식(土壤移植) 활착(活着)에 영향(影響)을 주는 요인(要因)들이 검토되었다.

• 한국약용작물학회지
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• 제7권4호
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• pp.296-302
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• 1999

인삼 조직배양에 있어 multi-shoot 대량번식을 통한 이차대사산물의 이용가능성을 조사코자 강제통기방식에 의해 $CO_2$를 기내에 공급하여 배배양하였던 바 multi-shoot 분화특성 및 사포닌 함량에 미치는 $CO_2$의 효과는 다음과 같다. 부정아 수와 부정아 유래의 신초수는 무처리와 $CO_2$ 2처리구간에 차이가 적었고 분화율은 50%내외이었고 부정아에서 분화한 신초는 경엽의 전개가 빠르고 생장량이 높은것이 특징이었다. 한 개의 자엽에서 분화되는 shoot primordium의 수는 대체로 15.4개-23.9개로 $CO_2$ 2, 500ppm처리구가 가장 양호하였고 $CO_2$ 10, 000ppm의 고농도는 오히려 shoot primordium수 뿐만 아니라 신초 분화율도 저하시켰다. 무처리의 건물율은 7,50%이었던데 반하여 $CO_2$ 2, 500ppm처리구는 건물율이 8.59%로 여타 $CO_2$ 처리구에 비하여 가장 높았다. 기내개화율은 무처리가 7.6%이었으나 $CO_2$, 2, 500-5, 000ppm처리구는 16.3-15.7%로 무처리에 비하여 2배 가량 높았다. 그러나 1개의 치상 배에서 얻어지는 개화수는 1.2-1.3개로 $CO_2$ 처리농도에 따른 차이가 없었다. 조사포닌 함량은 $CO_2$ 2, 500ppm처리구의 경우, 캘러스와 신초가 혼재되어 있는 소식물체는 5.80%이었던데 비하여 multi-shoot가 8.32%로 높았고 ginsenoside함량은 multi-shoot의 경우, ginsenosid Rd, Re 그리고$Rg_1$이 특히 많았다.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1121-1129
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• 2016

밀의 고분자 글루테닌 서브유닛[high molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS)]은 밀가루의 성질을 결정하는데 가장 중요한 요소이며 가공적성을 나타내는데 중요한 역할을 수행한다. 우리는 Agrobacterium 동시 형질전환법을 이용하여 한국 밀 품종인 ‘조경’으로부터 밀 HMW-GS을 암호화하는 TaGlu-Ax1 유전자를 가지는 marker-free 형질전환 벼를 생산하였다. TaGlu-Ax1 유전자의 종자 특이적 발현을 위하여 밀에서 존재하는 TaGlu-Bx7 유전자의 자체 프로모터를 벡터 내에 삽입하였다. 동시 접종을 위해서 오직 TaGlu-Ax1 유전자와 hygromycin phosphotransferase II (HPTII) 저항성 유전자만으로 구성된 두 종류의 발현 카세트를 독립적으로 Agrobacterium EHA105에 도입하였고, TaGlu-Ax1와 HPTII가 도입된 각각의 EHA105 Agrobacterium을 3:1 비율로 혼합하여 벼 캘러스에 접종하였다. 210개의 HPTII 저항성 형질전환체 중에서 벼 게놈에 TaGlu-Ax1과 HPTII가 모두 삽입된 20개의 형질전환 라인을 획득하였다. TaGlu-Ax1와 HPTII가 벼 게놈에 도입된 것을 Southern blot을 통해서 다시 확인하였다. 형질전환 벼 T₁ 세대의 종자에서 밀 TaGlu-Ax1 유전자가 전사와 번역되어 오직 TaGlu-Ax1만을 가지는 marker-free 식물체를 T₁세대에서 성공적으로 선발할 수 있었다. TaGlu-Ax1 유전자가 발현되는 marker-free 형질전환 식물체는 야생형(wild type)과의 표현형 차이는 없었다. 형질전환 벼의 쌀가루의 제빵적성을 비교하였을 때 TaGlu-Ax1 유전자만이 발현되어서는 제빵적성이 더 나아지지 않았다. 그러므로 더 많은 밀 고분자 및 저분자 글루테닌, 글리아딘의 유전자의 집적과 조합이 쌀가루 가공적성을 증진시키는데 필요하다. 결론적으로 TaGlu-Ax1 marker-free 형질전환 벼는 쌀가루 가공적성을 증진시키는데 좋은 재료로 사용될 것이다.

• 한국산림과학회지
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• 제85권2호
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• pp.300-308
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• 1996

낙엽송(Larix leptolepis Gordon)의 삽목발근에 관련된 제(諸) 요인(要因)을 구명하기 위하여 녹지삽목 시기인 7월 10일을 전후해서 6월 24일부터 7월 25일까지 일주일 간격으로 5주간 삽수를 채취하여 삽수내 수분함량, 탄수화물함량, 무기물함량을 조사하고, IAA 함량은 2주일 간격으로 3회 조사하였으며, 십목 후 매주 삽수를 굴취하여 뿌리 발달과정을 조사하였다. 클론 별 IAA 함량에서는 발근이 잘되는 클론이 발근 어려운 클론의 삽수 생중량 g당 평균 $1.26{\mu}g$에 비하여 $1.31{\mu}g$으로 다소 많은 경향을 나타내었다. 녹지삽목의 적절한 시기로 판단되는 7월 8일에서 15일 사이 삽수의 수분 함량은 발근 잘되는 클론이나 그렇지 안은 클론 각각의 수분함량은 76%, 75%로 조사되었다. 갱생기(更生枝)(hedged branch) 삽수(揷穗)의 탄수화물, 인산, 질소 함량은 각각 19.8%, 0.61%, 1.87%로 처리하지 않은 비교목(比較木) 삽수(揷穗)의 13.8%, 0.41%, 1.42%에 비하여 함량이 많았다. 탄수화물의 함량과 C/N율도 갱생지의 삽수가 비교목의 삽수보다 높았다. 클론간 탄수화물의 함량은 삽목 시기인 7월 8일 과 15일에 발근이 우수한 클론은 16.2%와 12.6%인데 비하여 발근 불량한 클론은 10.2%와 7.8%로 우수클론이 비교적 많은 경향을 보였다. C/N율도 삽목 시기부터 발근이 우수한 클론에서 높은 값을 보였다. 무기성분의 경우 $Mg^{{+}{+}}$, $K^+$, $Ca^{{+}{+}}$은 발근 불량클론이 많았으나 인산은 발근 우수클론이 많았다. 낙엽송 삽목(揷木) 발근(發根)에 관여(關與)하는 물질(物質)은 특정한 한가지 물질에 의하여 좌우하는 것이 아니라 탄수화물, 질소, C/N율, K/C율, 인산 등의 여러 가지 물질이 복합적으로 관여하는 것으로 판단된다. 원근기(原根基)가 나타나는 시기는 삽목 1주일 후부터이며 그 위치는 대부분의 사부조직 이지만 극히 일부는 캘러스 조직에서도 관찰되었다. 근기(根基)는 대개 2주 후부터 관찰되었고 새로운 뿌리로의 발달은 빠르면 3주 후에 삽수의 표피 외부로 나타나고 대개 삽목 5주 후부터 뿌리로 발달되었다.

• 생명과학회지
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• 제22권9호
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• pp.1152-1158
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• 2012

작물의 수확량이나 병 저항성을 증가시키는 형질전환 식물체 개발은 세계 식량 부족을 해결하는 좋은 방법이다. 하지만 항생제나 제초제의 사용은 형질전환 작물의 안전에 대해서 일반 사람들의 심각한 우려를 초래한다. 본 연구에서는, 아그로박테리움을 이용한 동시 형질전환 방법을 이용하여 한국의 밀 재배종인 '조경밀'의 유전자인, 고분자 글루테닌 서브유닛[high molecular-weight glutenin subunit (HMW-GS)] $D{\times}5$가 삽입된 마커프리 형질전환벼를 개발하였다. 각각 $D{\times}5$ 유전자와 하이그로마이신(HPTII) 저항성 유전자만으로 구성된 두 종류의 발현 카셋트(Two expression cassettes)를 독립적으로 아그로박테리움 EHA105에 도입하였고, $D{\times}5$와 HPTII가 도입된 각각의 EHA105 아그로박테리움을 3:1 비율로 혼합하여 벼 캘러스에 접종하였다. 66개의 HPTII 저항성 형질전환체 중에서 벼 게놈에 $D{\times}5$와 HPTII가 모두 삽입된 2개의 형질전환 라인을 획득하였다. $D{\times}5$와 HPTII가 벼 게놈에 도입된 것을 Southern blot을 통해서 다시 확인하였다. 또한, semi-quantitative RT-PCR을 통해 형질전환벼 $T_1$ 세대 종자의 밀 $D{\times}5$ 전사여부를 확인하였고 결국, $D{\times}5$ 유전자만을 가지는 마커프리 형질전환벼를 $T_1$ 세대에서 선발할 수 있었다. 본 연구 결과는 두 종류의 발현 카셋트를 사용한 아그로박테리움 동시 접종 시스템이 마커프리 형질전환벼를 생산하기 위한 효과적인 전략이 될 수 있음을 보여준다.

• 생명과학회지
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• 제24권6호
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• pp.618-625
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• 2014

쌀가루는 많은 식품 가공에 이용된다. 그러나 밀가루 반죽이 빵과 면을 포함한 많은 식품 가공 제품에 적합한 반면에, 쌀로 만든 반죽은 신장성과 탄력성이 부족하다. 고분자 글루테닌 서브유닛(HMW-GS)은 밀의 가공 적성을 결정하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구에서, 우리는 아그로박테리움(Agrobacterium) 동시 형질전환법을 이용하여 한국 밀 품종인 '조경'으로부터 HMW-GS를 암호화하는 밀 Glu-1Dy10 유전자를 발현하는 marker-free 형질전환 벼 식물체를 개발하였다. 오직 Glu-1Dy10 유전자와 HPTII (hygromycin phosphotransferase II) 저항성 유전자만을 포함하는 분리된 DNA 조각들로 구성된 두 가지 발현 카셋트(cassettes)를 독립적으로 아그로박테리움(Agrobacterium) EHA105 에 도입하였다. Glu-1Dy10 또는 HPTII를 함유하는 EHA105 를 각각 3:1 비율로 벼 캘러스에 접종하였다. 290개의 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 $T_0$ 식물체 중에서 우리는 벼 게놈에 Glu-1Dy10과 HPTII 유전자가 모두 삽입된 29개의 형질전환 라인을 획득하였다. 우리는 Glu-1Dy10 유전자가 벼 게놈 내로 도입된 것을 Southern blot 분석을 통해 다시 확인하였다. 형질전환 벼 종자에서 Glu-1Dy10의 전사(Transcripts)와 단백질을 semi-quantitative RT-PCR과 Western blot 분석을 통해서 확인하였다. 최종적으로, 오직 Glu-1Dy10 유전자를 갖는 marker-free 식물체를 $T_1$ 세대에서 성공적으로 선발할 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제19권6호
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• pp.471-477
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• 2004

중국의 약용 식물들은 중국에서 전통적으로 많은 질병을 예방하거나 치료하는데 쓰여 왔다. 백화사설초는 항암 활성을 지닌 중국의 약용 식물 중의 하나이다. Triterpenoid 화합물인 oleanolic acid와 ursolic acid는 이성질체이며 백화사설초에 포함되어있다 이들은 간 보호, 항염증, 항암, 항체형성 촉진 등의 효과가 알려져 있다. 유용물질을 생산할 목적으로 식물세포배양을 이용할 경우에는 배양조건을 제어함에 따라 유용물질을 포함한 세포를 효율적으로 얻을 수 있으며 수확도 쉽다. 따라서 백화사설초로부터 현탁세포를 유도하기 위해 기본적인 생장조절제인 2,4-D와 kinetin을 사용하였다. 무균 조건하에서 발아시킨 백화사설초의 잎을 사용하여 0.5 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose가 첨가된 Schenk 및 Hildebrandt 배지에서 캘러스를 처음으로 유도하였다. 백화사설초의 현탁세포 유도와 oleanolic acid의 생산성을 위한 최적의 생장조절제 조건은 0.75 mg/L의 2,4-D와 0.1 mg/L의 kinetin이 첨가된 경우였다. Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역상 컬럼을 사용한 HPLC로 분석하였는데, Rexchrom S5-100-ODS column의 분리능이 가장 좋았다. Spectrophotometer와 photodiode array detector를 사용하여 oleanolic acid와 ursolic acid의 최적 UV 파장을 검색한 결과, 200 nm에서 최적의 UV 흡광도가 나타났다. 이동상은 acetonitrile과 water를 80 : 20으로, 유속은 1.0 mL/min로 결정하였다. Oleanolic acid의 생산을 증대시키기 위해 signal transducer와 abiotic elicitor를 배양 6일째 첨가하였고, 배양 10일째 수확하였다. 10 mM의 methyl jasmonate, 0.5 mM의 salicylic acid, 0.1 mM의 vanadyl sulfate를 처리했을 경우, 각각 63.6, 99.6, 67.0 mg/L의 oleanolic acid가 생산되었고, 이것은 control에서 생산된 양 (57.4 mg/L)보다 높았다. 특히, 0.5 mM의 salicylic acid를 처리한 경우는 control에 비해 1.74배로 증가하였다. Methyl jasmonate 100 mM을 배양 6일째 첨가했을 때의 세포생장 변화를 보면, 첨가 후 2일이 지나면서부터 세포의 양이 크게 감소하기 시작하여 첨가 4일 후부터는 변화가 없었다. 따라서 methyl jasmonate를 처리 후 4일이 지나면 세포가 모두 죽는다는 것을 알 수 있었다. Methyl jasmonate 100 mM을 첨가한 후 4일째에 수확한 세포로부터 나온 oleanolic acid의 앙은 5.3 mg/L로 매우 적었다. 반면에 첨가 후 2일째에 수확한 세포로부터 나온 양은 94.1 mg/L로 control (43.4 mg/L)에 비해 2.17배로 증가되었다.